Un grupo de investigadores de la Facultad de Ciencias de la Agricultura de la Universidad de Hohenheim, en Stuttgart, Alemania, desarrolló un método para infectar artificialmente hojas de vid con el patógeno del mildiu o peronospora, lo que permite un reconocimiento y diferenciación precisa de las hojas sanas y las enfermas. Con técnicas de teledetección, luego se pueden dosificar de manera dirigida los fungicidas necesarios, evitando la sobreaplicación y contribuyendo a sanear el medio ambiente.
La enfermedad del mildiu o peronospora, causada por el oomycete Plasmopara viticola (P. viticola), afecta a la mayoría de los cultivos de vid (Vitis vinifera L.) en todo el mundo y generalmente se lo controla con fungicidas, que a menudo se aplican en exceso. La reducción del uso de fungicidas a través de la detección temprana de patógenos es, por lo tanto, un objetivo importante, que podría ser apoyado por técnicas de detección remota óptica emergentes que detecten cambios sutiles en el fenotipo de la hoja asociado con la enfermedad.
Sin embargo, la variabilidad considerable en las estructuras de las hojas de la vid plantea un desafío importante en la aplicación de técnicas de teledetección óptica para la identificación temprana del moho velloso característico de la peronospora.
Para abordar este problema, se ideó un método simple y eficaz para inocular artificialmente la infección de P. viticola en vides vivas, permitiendo infecciones programadas con un período de incubación promedio de 5 días. Este método no es destructivo, está altamente dirigido y difiere de las técnicas existentes al evitar la eliminación de hojas y los patrones de infección difusa, mientras que es rápido y fácil de realizar.
La restricción de la infección a áreas pequeñas y definidas en las hojas individuales permite comparaciones directas entre el tejido sano e infectado dentro de la misma hoja, minimizando los efectos de variabilidad. Este protocolo de infección precisa ofrece ventajas significativas para las aplicaciones de detección remota, el desarrollo de modelos de detección de patógenos y el apoyo a análisis detallados del desarrollo, lo que contribuye a una mejor detección temprana a través de métodos de visualización normales y técnicas de detección remota óptica emergentes y una posible reducción en el uso de fungicidas.
Introducción
La mayoría de los cultivos de las principales especies de vid del mundo (Vitis vinifera L.), son altamente susceptibles a la Plasmopara viticola, el agente causal del mildiu o peronospora. La gravedad de la infección está fuertemente influenciada por las condiciones ambientales locales. Bajo clima húmedo y moderado, P. viticola penetra los estomas de las hojas e inicialmente coloniza el espacio intercelular de la mesofila esponjosa, causando daños sustanciales a los tejidos verdes y dando como resultado pérdidas significativas de rendimiento y calidad.
La protección eficaz de la vid requiere típicamente múltiples aplicaciones de fungicidas. Los esfuerzos para reducir el uso de fungicidas incluyen la replantación de cultivos resistentes y el despliegue de sistemas de previsión de infecciones como VitiMeteo-Plasmopara. Sin embargo, las aplicaciones específicas y basadas en las necesidades siguen siendo esenciales para minimizar el impacto ambiental.
El monitoreo convencional de enfermedades en cualquier cultivo se basa en la evaluación visual, que es subjetiva, lenta y limitada al espectro visible. Los avances en la detección remota basada en modelos y las tecnologías de sensores ópticos ahora permiten la detección temprana de cambios fisiológicos en las plantas asociadas con el estrés biótico o abiótico. Los sensores espectrales permiten la identificación temprana de enfermedades de las plantas de los cambios bioquímicos y biofísicos mediante la detección de cambios relacionados con la infección en la reflectancia de las hojas.
Sin embargo, la validación en el campo de las enfermedades de la vid sigue siendo un desafío, ya que la arquitectura de las copas de la vid puede oscurecer las hojas afectadas, y las tensiones abióticas y bióticas introducen variabilidad de la señal. Además, los estudios que utilizan datos hiperespectrales y multiespectrales han puesto de relieve los principales obstáculos, incluida la comparabilidad limitada entre los tejidos de la vid sanos e infectados y baja resolución espacial, que se informa en otros cultivos. La morfología de las hojas, la estructura y la variabilidad de la edad dentro y a través de los cultivos de la vid y otras especies, como el maíz, complican aún más los análisis cualitativos y cuantitativos, que requiere muestreo extenso. Los enfoques adicionales, como la formación de imágenes térmicas, han demostrado que la actividad patógena temprana se puede detectar en función de la dinámica alterada de la temperatura de la hoja de la vid, aunque las variables ambientales como la lluvia y la radiación solar pueden distorsionar los resultados. Por ejemplo, se demostró que los efectos de inoculación sobre la temperatura de la hoja difieren entre las vides irrigadas y las vides sometidas a estrés por agua.
En conjunto, estos hallazgos subrayan la necesidad de metodologías perfeccionadas para apoyar los enfoques de aprendizaje automático y la modelización para la capacitación de tecnologías de teledetección óptica. Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron: 1) establecer sitios de infección a pequeña escala que permitieran la referenciación precisa de tejidos sanos e infectados dentro de la misma hoja, 2) inducir infecciones aisladas y predefinidas para permitir observaciones de alta resolución, y 3) desarrollar un protocolo de infección simple y rápido en condiciones controladas para avanzar en la detección de enfermedades basadas en sensores y profundizar la comprensión de la patogénesis de P. viticola.
Materiales y métodos
1. Material de la vid. Se utilizaron plantas clonales del cultivo de Vitis vinífera Bacchus, conocido por su alta susceptibilidad a P. viticola. Las vides se cultivaron en macetas en condiciones de invernadero controladas y libres de enfermedades y variaron en edad de dos a cuatro años. Para los procedimientos de preinfección e infección, sólo se seleccionaron las hojas completamente ampliadas cuarta y quinta. Durante el período de incubación posterior a la infección, las macetas se cubrieron para evitar la humedad excesiva del suelo causada por los niveles de humedad elevados.
2. Material patógeno. El aislado de campo 1136 de P. viticola, obtenido de Gómez-Zeledón et al. (2013), y sus clones derivados se utilizaron exclusivamente. Este aislado se eligió en base a su alta virulencia contra una amplia gama de genotipos de vid. La esporangia se propagó recientemente o se almacenaron en seco a -70 °C para su uso posterior.
3. Solución de propagación
Un método de propagación in vitro para P. viticola, desarrollado adicionalmente en base a Gómez-Zeledón et al. (2013), fue utilizado. La propagación se llevó a cabo en agua destilada suplementada con albúmina de suero bovino (BSA) y nitrato de calcio para mejorar la estabilidad de los patógenos y prolongar la viabilidad de las hojas desprendidas, asegurando de este modo la formación consistente de esporangia. El medio de propagación consistió en 2 μg/ml de BSA (Merck Darmstadt,Alemania, cat. n oo 1.12018.0025) y 0,42 μg/ml de Ca(NO 3)2 *4 H 2 O (Carl Roth Karlsruhe, Alemania, cat. n o P740.4). La solución se almacenó a 8 °C y permaneció estable durante al menos dos semanas.
4. Condiciones ambientales. La propagación, la infección y la incubación se realizaron en condiciones ambientales controladas de la siguiente manera:
- Incubadora: fotoperíodo de 16 horas (condiciones de larga duración) a 18 °C y 60% de humedad relativa.
- Cámara climática/túnel polivinílico: fotoperíodo de 16 horas a 22-24 °C, 40-60 % de humedad relativa durante la fase ligera; 18 °C y 85–98 % de humedad relativa durante la fase oscura.
Resultados
Los autores Spring et al. (1998), Gómez-Zeledón et al. (2013) desarrollaron un método de propagación in vitro modificado para P. viticola, que sirvió de base para el procedimiento presentado en este estudio. Sobre la base de este enfoque, se desarrolló un nuevo protocolo de infección para permitir el desarrollo preciso y localizado de los síntomas en las hojas de vid vivas y para simplificar el método de inoculación de gotitas empleado por Stoll et al. (2008), Cséfalvay et al. (2009), y Grünwald (2024). El método está estructurado en tres fases (Figura 1):
1. Evaluación de la propagación in vitro (pre-infección)
Después de un período de incubación de 4 a 5 días, apareció un recubrimiento de gris blanquecino en la superficie de la hoja abaxial (Figura 2). La esporulación típicamente cubría toda la superficie inferior de la hoja. La esporangia y los esporangióforos se examinaron microscópicamente, prestando especial atención a las estructuras ramificadas típicas y la densidad general de la esporangia. Se consideró que la presencia suficiente y el desarrollo adecuado de la esporangia eran más críticos que la cantidad absoluta para asegurar resultados de infección homogéneos.
2. Sucesión de síntomas y éxito del procedimiento de infección por Plasmopara viticola (infección y post-infección)
Se inocularon un total de 312 hojas (dos hojas por planta) de 156 vides en macetas con esporas generadas durante el proceso de propagación in vitro. Entre estos, 266 hojas (85,3 %) mostraron sitios de infección exitosos y delimitados con precisión en el día 7.
viticolaSe observaron los primeros signos visibles de esporulación de P. viticola en la superficie inferior de la hoja de las hojas inoculadas de plantas en macetas entre cuatro y siete días después de la infección, y se observó más del 80% de ellas en cinco días.
Los sitios de infección por P. viticola en la superficie abaxial (inferior) de las hojas inoculadas correspondieron precisamente al tamaño del fragmento de hoja infectado (~5 mm 2) aplicado durante la inoculación. No se observó más propagación más allá del área de infección inicial, como se confirmó por imágenes de fluorescencia de clorofila. Además, no apareció decoloración visible en las superficies de las hojas adaxiales (superior) dentro de los primeros ocho días después de la infección (Figura 3).
Discusión
Como uno de los patógenos más importantes en la viticultura, P. viticola ha sido ampliamente estudiado para mejorar la comprensión de su comportamiento y desarrollar estrategias efectivas de manejo de la enfermedad. La investigación actual se está centrando cada vez más en las tecnologías modernas de sensores para la detección temprana de patógenos para ayudar a la gestión y reducir el impacto de las enfermedades en numerosos cultivos, incluidas las vides.
El método presentado aquí es un modelo para entrenar aplicaciones de sensores ópticos para la detección temprana de mildius vellosos para apoyar este progreso al permitir la observación precisa de los síntomas de la enfermedad temprana desde el inicio de la infección por P. viticola y facilitando la referenciación directa de tejidos sanos e infectados dentro de la misma hoja. Con una tasa de éxito para la infección de la hoja superior al 85%, el método para crear el modelo es altamente confiable, requiere un equipo mínimo y es simple y rápido de realizar.
El modelo que se ha desarrollado, que se puede utilizar para entrenar sensores ópticos, simplifica la detección de señales de infección por P. viticola en una etapa temprana. En condiciones naturales, el tiempo exacto de infección es a menudo difícil de rastrear, y el material saludable de la hoja con una estructura de hoja idéntica suele faltar para la referencia basada en sensores.
Sólo unos pocos estudios sugieren que las modificaciones celulares tempranas, inducidas por toxinas fúngicas o respuestas de defensa de las plantas, son detectables a través de imágenes hiperespectrales. Además, los sensores RGB, térmicos y de fluorescencia han demostrado ser prometedores para la detección no invasiva de interacciones con patógenos mediante la detección de decoloración, necrosis y anomalías intercelulares. Sin embargo, los enfoques sensoriales deben desarrollarse continuamente en paralelo con los avances en la tecnología de sensores. En el futuro, el modelo de infección por P. viticola desarrollado en este estudio podría usarse para investigar más profundamente las interacciones de los huéspedes de la planta que pueden informar y entrenar nuevas tecnologías a medida que emergen. Los entornos controlados, como los utilizados en este estudio, ofrecen ventajas significativas para el monitoreo de la enfermedad, ya que las plantas se pueden evaluar en condiciones óptimas de luz desde múltiples ángulos y minimizar la confusión de estrés abiótico y biótico.
Se han utilizado otros métodos de inoculación para evaluar la obtención de imágenes ópticas para la detección temprana de enfermedades en vides, tales como la suspensión de P. viticola esporangia basada en gotas utilizada por Stoll et al. (2008). Sin embargo, estos enfoques tradicionales consumen más tiempo, requieren una preparación compleja de suspensiones de esporangia, a menudo con ajustes a la concentración de zoosporas, y exigen una mayor experiencia de los profesionales.
Por el contrario, este método, que necesita menos experiencia, agiliza el proceso de infección, requiriendo sólo de segundos a minutos por inoculación, al tiempo que garantiza una localización precisa sin la necesidad de un posicionamiento central entre las venas de las hojas o una manipulación prolongada de las hojas. La película líquida confinada entre el fragmento de hoja y la hoja intacta minimiza aún más la propagación de patógenos incontrolados, permitiendo que sólo se produzcan sitios de infección planificados. Actualmente, este método aún no se ha utilizado para probar métodos de sensores ópticos, pero se hará en futuros experimentos para probar este modelo de infección como una herramienta de evaluación.
Los hallazgos de invernadero proporcionan bases esenciales para avanzar en aplicaciones de campo para la detección óptica de enfermedades: a menudo, los tiempos de incubación para el desarrollo de la enfermedad asociados con patógenos como P. viticola y los entornos controlados pueden ser comparables a las condiciones de campo. Por lo tanto, los rasgos observados en condiciones controladas, tales como el tamaño de la lesión o los patrones de esporulación, pueden, en algunos casos, ser extrapolados a la configuración de campo.
Es importante destacar que el modelo de infección por P. viticola presentado en este estudio permite la inducción de los síntomas de la enfermedad en áreas de hojas claramente definidas, permitiendo una diferenciación precisa entre los tejidos infectados y los sanos. Esto facilita la identificación de los primeros cambios de señal inducidos por patógenos a través de diferentes variedades de vid que podrían detectarse mediante tecnologías de detección óptica y apoya el desarrollo de enfoques transferibles para el monitoreo de campo.
Además, el monitoreo cercano en etapa temprana puede permitir la detección de la enfermedad antes de que aparezcan los síntomas visibles, ofreciendo una herramienta valiosa para la intervención oportuna y contribuyendo a una reducción del uso de fungicidas.
Conclusión
El modelo de infección desarrollado en este estudio permitirá la inducción de infecciones precisas de P. viticola a pequeña escala en vides vivas mediante el establecimiento de sitios de infección individuales localizados, lo que permite la comparación directa entre tejidos sanos e infectados en la misma hoja. La mejora de la comprensión de las interacciones patógeno-huésped proporciona una base valiosa para el desarrollo y la validación de tecnologías de sensores ópticos para la detección temprana de enfermedades.
En el futuro, esto también podría contribuir a mejorar nuestra comprensión específica de los cambios fisiológicos y bioquímicos asociados con la infección temprana por parte de P. viticola, que a su vez podría avanzar aún más en la aplicación de nuevas estrategias de control. En comparación con las técnicas de inoculación existentes de P. viticola, el método es más simple, más rápido y requiere menos equipo y experiencia. A largo plazo, puede contribuir a estrategias de manejo de enfermedades más específicas y una reducción significativa en las aplicaciones de fungicidas.
Fuente: Revista científica IVES OENO ONE. Autores: Melissa Kleb, Reinhard Cremallera, Nikolaus Merkt, Christian Zörb. Artículo original completo en inglés: https://oeno-one.eu/article/view/9395
