La empresa mendocina AgroConciencia, dedicada al análisis de calidad alimentaria y seguimiento nutricional de los cultivos, sumó a sus servicios, en sociedad con el laboratorio marplatense Fares Taie, el análisis de determinación de Brettanomyces en vino a través de la técnica de citometría de flujo. Se trata de un método útil para el control microbiológico en las bodegas, y para la investigación de las dinámicas de crecimiento de los microorganismos en el vino. Esta práctica de laboratorio ofrece ventajas como rapidez en la determinación, detección simultánea de miles de células individuales, alta precisión, medición sincronizada de múltiples parámetros celulares, posibilidad de detectar la presencia de poblaciones heterogéneas (diferentes especies), preservación de la viabilidad celular y funciones celulares y facilidad de uso.
Aunque la población de hongos Brettanomyces evoluciona durante todas las etapas de la fermentación, los fenómenos volátiles se acumulan y no pueden ser eliminados. Entonces un control microbiológico tardío puede llevar a una ausencia de levaduras de contaminación, mientras que los fenoles volátiles están presentes. Sólo un seguimiento regular permite tener una visión completa de la evolución de una fermentación. Prevenir el deterioro durante el proceso de maduración, controlar la limpieza de los barriles, realizar muestras que contienen una cantidad significativa de levaduras de alta actividad.
Al respecto, y para resolver de manera rápida la detección de las brettanomyces, la empresa AgroConciencia está realizando el «Bretta Test» del laboratorio marplatense Fares Taie -especialistas en análisis de alimentos, productos farmacéuticos, veterinarios y ambientales con tecnología de alta complejidad- a través de la técnica de citrometría de flujo.
Brettanomyces es un género de hongos unicelulares (levaduras) importantes en la fabricación de cerveza y del vino ya que es resistente al etanol (alcohol) así que puede crecer tras el comienzo de la fermentación. Habitualmente su nombre se abrevia a brett. En el vino, es comúnmente considerado como un defecto en el mismo, aunque en bajos niveles, medido y controlado, añade mucho carácter a los vinos tintos.
La citometría de flujo es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz láser focalizado. El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula.
En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo, las células pueden estar vivas o fijadas pero, siempre, en suspensión celular y en forma de célula única. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz láser mediante un flujo continuo, cada célula, a la vez que dispersa la luz, si esa célula tiene alguna sonda fluorescente o fluorocromo, emitirá fluorescencia al ser excitada por el láser. Los citómetros de flujo están formados por complejos sistemas fluídicos, ópticos, detectores electrónicos, convertidores analógico-digitales y computadoras.
Este método sirve para la detección y recuento únicamente de las levaduras activas contaminantes y es muy útil para el control microbiológico en las bodegas, y para la investigación de las dinámicas de crecimiento de los microorganismos en el vino. Ofrece una serie de ventajas como la gran rapidez (y la detección simultanea de miles de células individuales), alta precisión, medición simultánea de múltiples parámetros celulares, posibilidad de detectar la presencia de poblaciones heterogéneas (por ejemplo diferentes especies simultáneamente), preservación de la viabilidad celular y funciones celulares y facilidad de uso.
A continuación replicamos un interesante informe técnico sobre el Bretta Test, cuyos autores son los especialistas Romina Ranocchia y Gonzalo López Lodi, del área citometría de flujo de Fares Taie.
Carácter «brettado» del vino
En el marco del sistema de control de calidad de una bodega es esencial contar con el concepto de vino de «calidad». Un vino defectuoso es aquel que presenta alguna característica desagradable percibida a nivel visual, olfativo y/o gustativo. Entre los defectos más comunes se encuentra el «bretado». Si bien no existe regulación en Argentina sobre los niveles de Bretta aceptables en el vino, el carácter «bretado» de un vino es uno de los atributos más controversiales y difíciles de encuadrar desde el punto de vista de la calidad, ya que, a partir de cierta intensidad puede generar rechazo por considerarse un defecto.
Esta levadura -Brettanomyces- aparece, sobre todo, en vinos tintos de calidad, y es responsable de la formación de compuestos aromáticos y gustativos como fenoles volátiles.
Se percibe tanto como un atributo positivo o negativo, dependiendo de los niveles de concentración de las sustancias responsables del olor (4-etilfenol 4EF, 4-etilguayacol 4EG). Las descripciones del carácter brett varían desde olores a sudor animal, heno, corral, establo, humo, cuero, témpera, medicinal, iodo, hongos, resina, lácteos, legumbres quemadas, entre otros.
La intensidad y los tipos de aromas asociados a estos compuestos, dependen del estado de la uva y de los procesos enológicos a los cuales ha estado sometido el vino, y particularmente al nivel de aplicación de Buenas Prácticas de Manufactura -más específicamente relacionadas a la higiene de la bodega y al lavado y acondicionamiento de barricas de madera.
La levadura más común: Brettanomices SP
- En el marco de los procesos fermentativos, Brettanomyces sp. (Dekkera, su forma sexual) es la levadura que más comúnmente produce este carácter «brett» al vino.
- Aportadas inicialmente por las frutas. Son utilizadas como auxiliares de fermentación . Entonces pueden estar presentes desde la fruta hasta el embotellado.
- Perfectamente adaptadas a las condiciones de fermentación, pueden sobrevivir y multiplicarse en un medio carenciado, ácido, alcoholizado o rico en azufre.
- Actualmente se reconocen varias especies de Brettanomyces/Dekkera: B. nanus, B. bruxellensis, B. anomlaus, B. custersianus, B. naardensis, entre otras.
- B. bruxellensis es la más relevante en cervezas y vinos. Responsable de la formación de compuestos aromáticos y gustativos como fenoles volátiles: 4-etil fenol (4EP), 4-etil guayacol (4EG), ácido isovalérico (IVA), ácido 3-metil butírico, entre las moléculas que otorgan el famoso carácter «bretado».
- Levadura alterante, de frágil desarrollo durante las etapas de fermentación del vino, y difícil de detectar en la uva de partida y en el vino terminado.
- Sin embargo, tiene una fisiología propicia para desenvolverse con comodidad en los largos períodos de envejecimiento en barrica, produciendo en su desarrollo metabolitos que deterioran irremediablemente la calidad del vino. Su deletéreo metabolismo produce etil y vinil fenoles, ácidos orgánicos y acetiltetrahidropiridinas, qué originan una significativa degradación de la calidad sensorial.
- Además, la expresión de actividad β-glucosidasa libera antocianidinas, deglucosilando los antocianos, y afecta de forma notable a la estabilidad de color.
- Su morfología es ojival con un diámetro inferior a 2-3 µm y una longitud que puede superar los 10 µm. Esto hace que las yemas más pequeñas tengan facilidad para atravesar membranas de 1 µm y probablemente también de 0,65 y 0,45 µm, lo que dificulta su eliminación del vino. Especialmente con membranas que no afecten la estructura coloidal y el color de los vinos tintos. Presenta en cultivos envejecidos un inicio de pseudomicelio ya que las células hijas quedan unidas a las parentales formando una estructura dendrítica.
- Puede utilizar un número elevado de moléculas como fuente de carbono siendo capaz de fermentar y asimilar glucosa y de forma variable puede utilizar sacarosa, maltosa, trealosa, glicerol e incluso etanol.
- El etanol posiblemente sea su fuente principal de carbono cuando se desarrolla en vinos secos durante el envejecimiento en madera. También la celobiosa hidrolizada de la celulosa de la madera puede ser asimilada por Brettanomyces.
Brettanomyces tiene una fisiología propicia para desenvolverse con comodidad en los largos períodos de envejecimiento en barrica.
Detección de Brettanomyces
Nunca hay fenoles volátiles sin Brettanomyces, pero puede haber Brettanomyces sin fenoles volátiles detectables en la degustación. Para limitar la producción de fenómenos volátiles hay que limitar la proliferación y la actividad de las Brettanomyces.
Brett tiene un crecimiento constante pero lento, por lo que aparece sólo meses después de finalizar la fermentación.
Aunque la población de Brettanomyces evoluciona durante todas las etapas de la fermentacion, los fenómenos volatiles se acumulan y no pueden ser eliminados. Entonces un control microbiológico tardío puede llevar a una ausencia de levaduras de contaminación, mientras que los fenoles volatiles están presentes. Sólo un seguimiento regular permite tener una visión completa de la evolución de una fermentación.
Bretta Test, por citometría de flujo
Es un test para detectar la presencia de Brettanomyces, con las siguientes características:
- Recuento de población total de levaduras viables
- Vitalidad
- Cualquier líquido que esté en proceso de fermentación (muestras de vino, sidra, cerveza)
- 90-120 minutos
- En comparación con los métodos clásicos, es más rápido y aporta un valor añadido real al servicio.
Prevenir el deterioro durante el proceso de maduración, controlar la limpieza de los barriles, realizar muestras que contienen una cantidad significativa de levaduras de alta actividad.
El conocimiento en tiempo real de los parámetros (población y nivel de actividad de Brettanomyces, así como su cinética) ofrece la oportunidad de evaluar los riesgos mucho antes de sufrir las consecuencias.
Ventajas del Bretta Test sobre las técnicas actuales
Cultivos microbiológicos:
- Técnica histórica utilizando medios de cultivo con agar específicos. El tiempo medio para tener un resultado confirmado es de 5 a 7 días. Las levaduras viables no cultivables no están contabilizadas.
- Bretta test caracteriza en menos de 2 horas el conjunto de las levaduras viables y viables no cultivables
Microscopía:
- Visualización de los microorganismos gracias al aspecto de las células. Este método es operador dependiente y solo un bajo número de tipo de células pueden ser identificadas.
- Bretta test junto a la citometría permite de enumerar varios miles de células en pocos segundos y entonces identificar pequeñas poblaciones.
- Junto a la microscopia, Bretta test lleva la especificidad de detección.
PCR:
- Los métodos de identificación genéticos son los más específicos. No obstante necesitan laboratorios organizados en flujo de trabajo unidireccional: no se hace la extracción en el mismo lugar que la amplificación. Les cuestan también hacer la distinción entre las vivas y las muertas en los protocolos estándares. Es también la técnica más cara.
- Bretta test es un método especifico permitiendo identificar las Brettanomyces viables y viables no cultivables.
Citometría con colorante de viabilidad único:
- Los métodos de análisis que utilizan solo colorantes fisiológicos permiten seguir las evoluciones de una producción pero sin llevar especificidad a lo que se está observando.
- Bretta test da la información de viabilidad además de la identificación especifica.
Los Bretta Test aplicados a la producción de vino como estrategia rutinaria, ayudan por lo tanto a anticipar muchos de los problemas que surgen, y reducen el riesgo de pérdida de calidad de los vinos y de los ingresos correspondientes. Representa para las bodegas un nuevo paradigma para conocer, anticipar, evitar alteraciones de vinos por fenoles y contaminación prematura de barricas.
Método validado: 100 UFC/mL a 9×105 UFC/Ml:
- La muestra según el origen/tipo deberá ser concentrada o diluida previo a la incubación con Bretta Test.
- La máxima concentración detectada es 4 x105 brett/mL
- Reacción cruzada principalmente con zygosaccharomyces, mínima con algunas cepas de saccharamyces y nula con torulaspora.
Limitaciones:
- En levaduras ocurren mutaciones espontáneamente, algunas cepas de brettanomyces pueden no ser detectadas por el kit. Algunas cepas reaccionan más intensamente que otras.
- Moléculas de clorofila y antocianica pueden aumentar la tinción de las levaduras y aumentar la fluorescencia del background.
Tipos de muestras que se pueden analizar:
- Iniciadores (Starters)
- Muestras de vino, sidra, cerveza o cualquier líquido que esté en proceso de fermentación
- Vinos almacenados en barricas
- Vinos embotellados
- Muestras de agua de lavado
- Levaduras cultivadas
Planificación para Bretta Test
El flujo de trabajo laboratorio Fares Taie y Agroconciencia es el siguiente:
- Toma de muestras: Siempre debe realizarse de la misma manera para permitir la comparación de resultados. Homogeneizar el depósito o la barrica y colocar 15 mL de muestra en un tubo tipo falcon estéril. No congelar la muestra.
- Rotulado: rotular las muestras e identificar en el formulario de identificación del solicitante todos los datos solicitados para cada una de ellas.
- Empaquetamiento y transporte: Envío refrigerado via Bus Pack (aéreo), tiempo de demora 24 a 48 hs
- Informe de resultados / tiempos de promesa: Se realiza un informe en pdf y se envía por e mail, con un tiempo de promesa de 5 días.
Resultados obtenidos en ensayos de puesta a punto con Bretta Test
Detección Bretta, ensayos de vinos en Mendoza:
Fuentes: Universidad Autónoma de Madrid, Infowine, Laboratorio Fares Taie y AgroConciencia
