El caracter «brett» de un vino, a partir de cierta intensidad, puede considerarse un defecto, afectando notoriamente la calidad del producto. Puede generar en el vino descriptores olfativos que van desde olores a sudor animal, heno, corral, establo, humo, hasta cuero, témpera, medicinal, iodo y hongos.
Para detectar y cuantificar de manera simultánea la presencia de brettanomyces y no brettanomyces, se puede hacer un test por citrometría de flujo, llamado Bretta Test y que en Argentina realiza la empresa mendocina Agroconciencia Argentina en sociedad con el laboratorio marplatense Fares Taie. El test se realiza en cualquier líquido que esté en proceso de fermentación (muestras de vino, sidra, cerveza) y tarda 90 a 120 minutos.
En el marco del sistema de control de producto de una bodega es esencial contar con el concepto de vino de calidad. Un vino defectuoso es aquel que presenta alguna característica desagradable percibida a nivel visual, olfativo o gustativo. Entre los defectos más comunes se encuentra el carácter «bretado», una de las percepciones más controversiales y difíciles de encuadrar desde el punto de vista de la calidad, ya que, a partir de cierta intensidad, puede generar rechazo por considerarse un defecto.
Carácter «bretado» del vino
Es causado por levaduras del género Brettanomyces, que son las responsables de la formación de compuestos aromáticos y gustativos como fenoles volátiles. Se percibe tanto como un atributo positivo o negativo, dependiendo de los niveles de concentración de las sustancias responsables del olor (4- etilfenol 4EF, 4-etilguayacol 4EG).
Las descripciones del carácter bretado o carácter brett varían desde olores a sudor animal, heno, corral, establo, humo, cuero, témpera, medicinal, iodo, hongos, resina, lácteos, legumbres quemadas, entre otros. La intensidad y los tipos de aromas asociados a estos compuestos dependen del estado de la uva y de los procesos enológicos a los cuales ha estado sometido el vino, y particularmente al nivel de aplicación de Buenas Prácticas de Manufactura, más específicamente relacionadas a la higiene de la bodega y al lavado y acondicionamiento de barricas de madera.
Qué son las Brettanomyces SP
En el marco de los procesos fermentativos, Brettanomyces sp. (Dekkera su forma sexual) es la levadura que más comúnmente produce este carácter «brett» al vino. Aportadas inicialmente por las frutas, son utilizadas como auxiliares de fermentación, con lo cual pueden estar presentes desde la fruta hasta el embotellado.
Perfectamente adaptadas a las condiciones de fermentación, pueden sobrevivir y multiplicarse en un medio carenciado, ácido, alcoholizado o rico en azufre. Actualmente se reconocen varias especies de Brettanomyces/Dekkera: B. nanus, B. bruxellensis, B. anomlaus, B. custersianus, B. naardensis, entre otras.
La más relevante en cervezas y vinos es la B. bruxellensis, responsable de la formación de compuestos aromáticos y gustativos como fenoles volátiles: 4-etil fenol (4EP), 4-etil guayacol (4EG), ácido isovalérico (IVA), ácido 3-metil butírico, entre las moléculas que otorgan el famoso carácter «brett».
Esta levadura es alterante, de frágil desarrollo durante las etapas de fermentación del vino, y difícil de detectar en la uva de partida y en el vino terminado. Sin embargo, tiene una fisiología propicia para desenvolverse con comodidad en los largos períodos de envejecimiento en barrica, produciendo en su desarrollo metabolitos que deterioran irremediablemente la calidad del vino. Su deletéreo metabolismo produce etil y vinil fenoles, ácidos orgánicos y acetiltetrahidropiridinas, qué originan una significativa degradación de la calidad sensorial. Además, la expresión de actividad β-glucosidasa libera antocianidinas, deglucosilando los antocianos, y afecta de forma notable a la estabilidad de color.
Su morfología es ojival con un diámetro inferior a 2-3 µm y una longitud que puede superar los 10 µm. Esto hace que las yemas más pequeñas tengan facilidad para atravesar membranas de 1 µm y probablemente también de 0,65 y 0,45 µm, lo que dificulta su eliminación del vino. Especialmente con membranas que no afecten la estructura coloidal y el color de los vinos tintos. Presenta en cultivos envejecidos un inicio de pseudomicelio ya que las células hijas quedan unidas a las parentales formando una estructura dendrítica.
Brettanomyces tiene una fisiología propicia para desenvolverse con comodidad en los largos períodos de envejecimiento en barrica.
Puede utilizar un número elevado de moléculas como fuente de carbono siendo capaz de fermentar y asimilar glucosa y de forma variable puede utilizar sacarosa, maltosa, trealosa, glicerol e incluso etanol. Éste último posiblemente sea su fuente principal de carbono cuando se desarrolla en vinos secos durante el envejecimiento en madera. También la celobiosa hidrolizada de la celulosa de la madera puede ser asimilada por Brettanomyces.
Detección de Brettanomyces
Lo ideal es detectar las Brettanomyces lo más pronto posible con el fin de evitar su desarrollo y la síntesis de esas moléculas que no podrán ser eliminadas más adelante.
Aunque la población de Brettanomyces evoluciona durante todas las etapas de fermentación, los fenoles volátiles se acumulan y no pueden ser eliminados. Entonces, un control microbiológico tardío puede llevar a una ausencia de levaduras de contaminación mientras que los fenoles volátiles están ya presentes. Nunca hay fenoles volátiles sin Brettanomyces, pero puede haber las Brettanomyces sin fenoles volátiles detectables en la degustación. Para limitar la producción de fenoles volátiles, hay que limitar su proliferación y su actividad.
Brett tiene un crecimiento constante pero lento, por lo que aparece sólo meses después de finalizar la fermentación.
Test por citometria de flujo
El conocimiento en tiempo real de los parámetros (población y nivel de actividad de Brettanomyces, así como su cinética) ofrece la oportunidad de evaluar los riesgos mucho antes de sufrir las consecuencias.
Para detectar y cuantificar de manera simultánea la presencia de brettanomyces y no brettanomyces; discriminar las que tienen actividad metabólica de otras levaduras y hacer un recuento de poblaciones totales de levaduras viables, se puede hacer un test por citrometría de flujo, se llama Bretta Test y lo utiliza la empresa mendocina Agroconciencia Argentina en sociedad con el laboratorio marplatense Fares Taie. El test se realiza en cualquier líquido que esté en proceso de fermentación (muestras de vino, sidra, cerveza) y tarda 90 a 120 minutos.
Bretta Test
Hasta hoy, no existían métodos realmente fiables de detección rápida y específica que respondieran a dos preguntas: presencia y viabilidad de las Brettanomyces. En este sentido, Bretta Test es un método de detección específico de estas levaduras por inmunofluorescencia o inmunocitometría, que detecta y cuantifica rápidamente la población de Brettanomyces con actividad metabólica.
Este test utiliza un anticuerpo, producido a partir de Brettanomyces de diferentes orígenes geográficos, desarrollado por Amarok Biotechnologies y acoplado con un marcador de viabilidad. De esta manera es posible detectar de manera simultánea las Brettanomyces y las no-Brettanomyces y determinar si están vivas o muertas, en 2 horas.
Con la citometría, es posible obtener la discriminación según el siguiente grafico:
Levaduras vivas = levaduras viables y viables no cultivables
Ventajas del Bretta Test sobre las técnicas actuales
Cultivos microbiológicos: Es una técnica histórica que utiliza medios de cultivo con agar específicos. El tiempo medio para tener un resultado confirmado es de 5 a 7 días. Las levaduras viables no cultivables no están contabilizadas. En comparación con este proceso se puede decir que la ventaja de Bretta test es que caracteriza en menos de 2 horas el conjunto de las levaduras viables y viables no cultivables.
Microscopía: Se trata de una visualización de los microorganismos gracias al aspecto de las células. Este método es operador-dependiente, y sólo un bajo número de tipo de células pueden ser identificadas. En este caso el Bretta test puede sumar la especificidad de detección, y gracias a la citometría puede enumerar varios miles de células en pocos segundos y entonces identificar pequeñas poblaciones.
PCR: Es un método de identificación genética, el más específico hasta ahora. No obstante necesita laboratorios organizados en flujo de trabajo unidireccional, es decir que no se hace la extracción en el mismo lugar que la amplificación. Y además les cuesta hacer la distinción entre las vivas y las muertas en los protocolos estándares. Y es la técnica más cara. En cambio, Bretta test es un método especifico a un precio asequible, permitiendo identificar las Brettanomyces viables y viables no cultivables.
Citometría con colorante de viabilidad único: Es un método de análisis que utiliza solo colorantes fisiológicos que permiten seguir las evoluciones de una producción, pero sin llevar especificidad a lo que se está observando. Bretta test, para este caso se diferencia porque da la información de viabilidad además de la identificación especifica.
El conocimiento en tiempo real de los parámetros (población y nivel de actividad de brettanomyces, así como su cinética) ofrece la oportunidad de evaluar los riesgos mucho antes de sufrir las consecuencias. Aplicados a la producción de vino como estrategia rutinaria, ayudan por lo tanto a anticipar muchos de los problemas que surgen, y reducen el riesgo de pérdida de calidad de los vinos y de los ingresos correspondientes. Representa para las bodegas un nuevo paradigma para conocer, anticipar, evitar alteraciones de vinos por fenoles y contaminación prematura de barricas.
No existe regulación en argentina sobre los niveles de bretta aceptables en el vino. Pero:
Obtención y tratamiento de las muestras
- Las muestras pueden ser tomadas del inicio del proceso en bodega, de la fermentación, de vinos embotellados, almacenados en barricas, en el agua de lavado y/o en levaduras cultivadas.
- La toma de muestras siempre debe realizarse de la misma manera para permitir la comparación de resultados: homogeneizar el depósito o la barrica y colocar 15 mL de muestra en un tubo tipo falcon estéril y no congelar la muestra.
- Se rotula
- Se hace un envío refigerado en avión que tarda entre 24 y 48 hs
- Se realiza el análisis y se envía por mail.
Método que utiliza el test
- Método validado: 100 UFC/mL a 9×105 UFC/Ml
- La muestra según el origen/tipo deberá ser concentrada o diluida previo a la incubación con Bretta test.
- La máxima concentración detectada es 4 x105 brett/mL
- Reacción cruzada principalmente con zygosaccharomyces, mínima con algunas cepas de saccharamyces y nula con torulaspora.
Limitaciones: En levaduras ocurren mutaciones espontáneamente, algunas cepas de brettanomyces pueden no ser detectadas por el kit. Algunas cepas reaccionan más intensamente que otras. Moléculas de clorofila y antociánica pueden aumentar la tinción de las levaduras y aumentar la fluorescencia del background.
