El «gusto a ratón» en el vino es un defecto sensorial de origen microbiano que aparece en la fase retronasal y que recuerda al olor de las jaulas de hámster. Está provocado por 3 compuestos N-heterocíclicos -2-acetilpirrolina (APY), la 2-acetiltetrahidropiridina (ATHP) y la 2-etiltetrahidropiridina (ETHP). Esta alteración, que no era muy habitual antes de 2010, se volvió más frecuente por la tendencia del aumento del pH de los vinos, así como por ciertas prácticas enológicas que tienden a disminuir la utilización del dióxido de azufre (SO2). En la actualidad no existen valores para medir los umbrales de detección de estos compuestos. Con el objetivo de cubrir esta laguna, un equipo de investigadores franceses desarrolló un método simple y eficaz para determinar simultáneamente en los vinos los tres compuestos N-heterocíclicos implicados.
Autores: Daiki Kiyomichi, Céline Franc, Pierre Moulis, Laurent Riquier, Patricia Ballestra, Stéphanie Marchand, Sophie Tempère, Gilles de Revel. Artículo publicado el 12/12/23 en la revista técnica de la Sociedad Internacional de Viticultura y Enología (IVES, por sus siglas en inglés).
La 2-acetilpirrolina (APY), la 2-acetiltetrahidropiridina (ATHP) y la 2-etiltetrahidropiridina (ETHP) son compuestos descritos como responsables del «gusto a ratón» en los vinos. No obstante, la medición de estos compuestos es compleja, en razón de sus particularidades fisicoquímicas.
Con el objetivo de obtener un método simple y eficaz para determinar simultáneamente la concentración de estos tres N-heterociclos en los vinos, un equipo de investigadores de la Universidad de Bordeaux y del Instituto Nacional de Investigación sobre Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente de Francia (Inrae), desarrolló una herramienta determinante para definir mejor esta alteración de los vinos y para protegerse de ella.
Una desagradable alteración del gusto y el olfato
El «gusto a ratón» es uno de los defectos del vino de origen microbiano. Este es descrito como particularmente desagradable, que recuerda a la orina o a la jaula de ratones, pero también y más a menudo a los alimentos tostados tales como las palomitas de maíz, los crackers y la corteza de pan, el arroz, o incluso la piel de salchichón. Si bien esta alteración olfativa ha sido efectivamente mal llamada, aparece más claramente cuando el vino es puesto en la boca. En efecto, los compuestos N-heterocíclicos implicados son poco volátiles al pH del vino. El pH bucal es más elevado que el del vino, lo que explica una percepción incrementada de este efecto al poner el vino en la boca por medio del retro-olfato. Descrito por Peynaud y Domercq desde 1956, este defecto guardaría relación con la presencia de levaduras de tipo Brettanomyces, según las citas de los profesionales australianos.
No obstante, antes de los años 2010, el defecto relacionado con el gusto a ratón era rarísimo. Este se volvió más frecuente estos últimos años, asociado con el aumento del pH de los vinos, así como con ciertas prácticas enológicas que tienden a disminuir significativamente la utilización del dióxido de azufre (SO2).
Hasta ahora, los datos de cuantificación de estos compuestos marcadores del gusto a ratón son limitados, por motivo de los desafíos analíticos relacionados con la naturaleza de estas moléculas así como de sus bajos contenidos, del orden de µg.L-1. Los contenidos señalados previamente en los vinos se sitúan entre 0,7 y 106 µg.L-1 para la AHTP; para la APY, una concentración de 7,8 µg.L-1 fue citada por Snowdon et. al., mientras que para la ETHP las concentraciones encontradas en el vino pueden sobrepasar los 150 µg.L-1.
En la actualidad no existen valores (no obstante bien útiles) para los umbrales de detección de estos diferentes compuestos, puesto que las medidas, poco comparables, han sido realizadas mediante protocolos sensoriales diferentes y en matrices diferentes. Con el objetivo de cubrir esta laguna y de comprender los parámetros que influencian la aparición del gusto a ratón, este estudio desarrolló un método simple y eficaz para determinar simultáneamente en los vinos los tres compuestos N-heterocíclicos implicados. De esta manera, se desarrollo una extracción por Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE, Twister®), seguida de un análisis por cromatografía en fase gaseosa acoplada a espectrometría de masa (GPC-MS). Esta técnica SBSE ya es empleada para asegurar una medición multi-defectos en los vinos.
Compuestos implicados en el gusto a ratón
Son principalmente tres compuestos: la 2-acetilpirrolina (APY), la 2-acetiltetrahidropiridina (ATHP) y la 2-etiltetrahidropiridina (ETHP), que son descritos como responsables del gusto a ratón en los vinos. Estos compuestos tienen la particularidad de coexistir bajo dos formas tautómeras (iminas o enaminas). La reactividad de las formas tautómeras con los protones del medio induce una modificación en su volatilidad relacionada con los valores de pH. Es importante caracterizar la presencia de estas moléculas en sus diversas formas y cuantificarlas para percibir la realidad de la alteración de los vinos más allá de la simple percepción olfativa que parece ser muy variable según los vinos o su estado de oxidorreducción. Su ausencia confirmada puede ser un punto importante cuando se sospecha equivocadamente la presencia del defecto o para evitar cualquier confusión.
Detección sensorial y desarrollo de un método estándar
Las diferentes fuentes de variabilidad (origen de los marcadores, concentraciones, especificidad de la matriz vino, capacidades de detección individuales, composición de la saliva del catador y pH, por ejemplo) explican en parte la ausencia de consenso con respecto a la percepción de este defecto en el vino. Diferentes métodos sensoriales de detección del carácter de ratón han sido desarrollados para el vino con ayuda de bandas de papel alcalino o ajustamiento del pH. Entre los métodos testeados, el ajustamiento del pH de los vinos tintos alrededor de 5 por adición de bicarbonato de sodio permite aumentar el consenso entre los catadores, así como sus capacidades de detección y de discriminación13.
Principio del método de análisis perfeccionado
El método de extracción SBSE-Twister® fue optimizado. Fue necesario aumentar el pH de la muestra. El objetivo es desplazar los equilibrios hacia las formas no protonadas, menos polares y más fácilmente extraíbles. En efecto, la SBSE se adapta a la extracción de los analitos apolares. Por lo demás, la adición de cloruro de sodio (NaCl) mejora la recuperación de los analitos al disminuir su solubilidad en la fase acuosa y aumenta su afinidad por la fase apolar del Twister®.
Así, para la preparación de la muestra, el pH es ajustado a 10,5 con una solución acuosa de soda cáustica (NaOH, 1 M). A 10 mL de la muestra a pH = 10,5 se agregan 2 g de NaCl. Después de la disolución completa del NaCl, el estándar interno (IBMP-d3) es agregado al frasco así como un Twister® en PDMS (Gerstel, 20 mm × 1 mm; largo × espesor de fase). Después de la extracción durante 1 h por agitación a 600 rpm, el Twister® es retirado de la muestra y desorbido en el GPC-MS para el análisis (Figura 1).
Con este método, las formas imina y enamina de la ATHP fueron detectadas, contrariamente a las formas enaminas de la APY y de la ETPH. Puede que el equilibrio esté muy fuertemente desplazado hacia las formas iminas, o bien la extractibilidad de las formas enaminas por el PDMS es bajo en razón de sus características químicas. De esta manera, la concentración de la ATHP es determinada por la suma del resultado para A-3,4,5,6-THP y A-1,4,5,6-THP. Los límites de detección (LD) y de cuantificación (LQ) de la APY, la ATHP y la ETHP para el vino blanco, rosado y tinto están dados en la Tabla 1.
Análisis de muestras de vino
El método optimizado fue aplicado al análisis de muestras de vinos comerciales de orígenes diferentes y producidos por medio de prácticas enológicas variadas. En este estudio fueron analizados seis vinos producidos con utilización «clásica» de SO2 y sesenta y ocho vinos producidos sin adición de SO2. La clasificación entre las dos categorías, adición convencional o limitada, se basa en las indicaciones con respecto a la utilización del SO2 en la etiqueta de la botella o según el productor. Se mostró que casi la totalidad de los vinos producidos con una cantidad limitada o sin SO2 contenían ETHP, mientras que el compuesto no fue cuantificable en los vinos sulfitados. Por otra parte, la APY y la ATHP fueron detectadas solo en vinos producidos con una cantidad limitada o sin SO2. En total, once vinos contenían APY y treinta y nueve vinos contenían ATHP (Figura 2). Los contenidos fueron siempre inferiores a 7,7 µg.L-1 para la APY, 54,5 µg.L-1 para la ATHP y variaron de 14,0 µg.L-1 a 120,5 µg.L-1 para la ETHP.
Estos resultados destacan varios puntos: para comenzar, la utilización convencional del SO2 podría limitar la aparición de heterociclos responsables del gusto a ratón. Por otra parte, la presencia de APY se asocia generalmente a la presencia de los otros dos heterociclos. Finalmente, los vinos bajo sospecha de alteración por el gusto a ratón pueden contener APY o ATHP, o bien ambos, pero a veces ninguno de los dos (presencia inferior al límite de detección). La ETHP, por su parte, se encuentra presente en casi la totalidad de los vinos producidos con una cantidad limitada o sin SO2. Otros análisis serán necesarios para confirmar estos primeros resultados en un número más importante de datos y muestras más diversificadas.
Conclusión
Se desarrolló un método bastante simple y accesible para los laboratorios equipados para determinar las concentraciones de compuestos N-heterocíclicos responsables del gusto a ratón. Este consiste en utilizar la SBSE o Twister® seguido de una cromatografía en fase gaseosa, así como una detección por espectrometría de masa. Este método permite verificar los resultados de las degustaciones confirmando o, al contrario, eliminando las dudas sobre una percepción compleja del defecto olfativo. Además, el mecanismo de generación del gusto a ratón aún no ha sido perfectamente elucidado. Varias hipótesis se inclinan a favor de una diversidad microbiana muy grande o de una modificación del equilibrio de oxidorreducción del vino. Se espera que este nuevo método contribuya a una mejor comprensión de este defecto, que se a vuelto excesivamente frecuente.
