En este artículo de divulgación científica, los expertos de la empresa de origen italiano AEB, líder en enología y biotecnologías, con filial argentina en Maipú, Mendoza, explican el concepto de prevalencia en enología y las dificultades asociadas a los procesos de propagación de la biomasa, así como las características de la competencia microbiana en el mosto.
La levadura seleccionada es uno de los pilares de la enología moderna, que ha asegurado la estandarización de los procesos de fermentación y un mayor control sobre los mismos.
De hecho, en la fermentación enológica, a diferencia de otros tipos de fermentación como es en el caso de la elaboración de cerveza (que también utiliza iniciadores microbianos similares en la mayoría de los casos), la competencia microbiana es un factor que puede jugar un rol decisivo en la calidad del producto final, ya que las especies microbianas nativas (también denominadas naturales o índígenas) asociadas a la uva podrían determinar un importante grado de variabilidad en las características del producto o incluso su potencial compromiso.
Biotecnología y el desarrollo de nuevas cepas de levadura
La uva es en sí misma una materia prima que introduce en el ambiente de la bodega un microbioma complejo formado por levaduras y bacterias de diferentes géneros (Oenococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Acetobacter, Gluconobacter, Hanseniaspora, Brettanomyces, Candida, Zygosaccharomyces, etcétera).
Es en este campo de batalla, el de la competición microbiana, es donde la biología y más tarde la biotecnología han contribuido de forma más significativa en los últimos 60 años. La investigación internacional ha tratado de aislar variantes fenotípicas de levadura enológica con rendimientos cada vez mayores, en diferentes ambientes (fermentaciones espontáneas, ambientes de bodega, superficie de las bayas) y, donde no ha podido, ha utilizado técnicas de breeding para llevar a cabo una mejora genética de cepas ya existentes.
El resultado final de estos esfuerzos ha sido, a lo largo de los años, el desarrollo de cepas de levadura de rendimiento cada vez mayor, libres de defectos metabólicos y organolépticos (fermentaciones paradas o retardadas, aumento de la acidez volátil, producción de sulfuros), más resistentes al estrés nutricional y caracterizadas por particularidades únicas (presencia de actividades enzimáticas específicas, reducida producción de SO2, fenotipo killer, caracteristicas aromáticas específicas, etc.).
Levadura seca activa como garantía de prevalencia
Es gracias a la introducción de la Levadura Seca Activa (LSA), tomada de otros sectores, que el importante trabajo de selección mencionado anteriormente se ha llevado al mercado y por lo tanto a las bodegas de todo el mundo, en un formato de fácil manejo y con sustanciales beneficios en términos de portabilidad y sobre todo de vida útil a mediano y largo plazo.
Utilizando LSA, empresas como AEB pueden garantizar la prevalencia de la levadura seleccionada durante la fermentación. El concepto de prevalencia es fundamental para el buen desarrollo tecnológico de la fermentación: un starter microbiano toma la prevalencia cuando asume el carácter de protagonista principal de la fermentación, suplantando numérica y metabólicamente a la población «mixta» de levaduras nativas.
La posibilidad de utilizar una levadura seleccionada en enología ha permitido mejoras significativas en los procesos de fermentación ya que las LSA permiten:
- un completo y predecible desarrollo de la fermentación alcohólica;
- la reducción de la acidez volátil asociada con fermentaciones espontáneas;
- la reducción de las características organolépticas anómalas relacionadas con las especies microbianas silvestres;
- la reducción de la presencia de moléculas nocivas de origen microbiano como las aminas biogénicas;
- la correcta gestión del tiempo y posible desvinculación de la fermentación maloláctica respecto a la fermentación alcohólica.
La prevalencia en números
El concepto de prevalencia es sinónimo no sólo del control del proceso de fermentación en bodega, sino también de la calidad del producto final, así como de su reproductibilidad. De hecho, es necesario disponer del correcto número de células para que las características del starter se expresen plenamente y que, de la misma forma, determinados defectos organolépticos o cualitativos ligados a especies indígenas se expresen en el vino acabado.
Para comprender plenamente la importancia de utilizar levadura seca activa en enología es necesario volver brevemente a considerar las condiciones microbiológicas de un mosto medio.
De hecho, debe tenerse en cuenta que dentro de un mosto puede haber de 103 a 105 células/mL de microorganismos «indígenas«; por ello es estrictamente necesaria una población de al menos 106 células de levadura si se quiere tener la prevalencia, es decir, una población de levadura que exceda en 10 veces la de los microorganismos indígenas. Si se considera que un preparado LSA medido consta de alrededor de 1010 células/g y que se recomienda utilizar 20 g/hL, el número correspondiente con relación a la unidad de volumen final es de tan solo 106 células/mL, lo que de hecho constituye el valor tecnológico asociado a este proceso y que permite a la población del starter suplantar a cualquier posible competidor.
La propagación de la biomasa
En los últimos tiempos, numerosos fabricantes de equipos se han convertido en expertos en microbiología y han introducido en el mercado equipos para la supuesta multiplicación de células de levadura en bodega, en una propuesta tecnológica que se propone como una alternativa a la LSA.
La pretensión detrás de dicho equipo (que generalmente consiste en simples depósitos a los que se les aplica un agitador y una resistencia con rudimentarios circuitos de control) es que se puede multiplicar una población celular, derivada de LSA o una levadura fresca aislada, en varios órdenes de magnitud; en muchos casos se pretende poder obtener multiplicaciones del orden de 100X con la consecuente obtención de cultivos puros que posteriormente se pueden utilizar como starter.
A menudo, como prueba de la eficacia multiplicadora de estas técnicas, se realizan análisis genéticos realizados en colonias aisladas al final de la fermentación: mediante técnicas de especies asignadas (patrón de restricción de las regiones ITS, secuenciación d2d2) y huella molecular (regiones InterDelta, patrón de amplificación de las regiones microsatélites) se demuestra la identidad sustancial entre el iniciador utilizado para arrancar el multiplicador de biomasa y la cepa de levadura aislada al final de la fermentación.
Los límites de los procesos «artesanales» de propagación de las levaduras
Sin embargo, este enfoque tiene algunas limitaciones conceptuales y técnicas importantes:
- En primer lugar, es totalmente previsible que la mayor parte de la población de levaduras detectada al final de un trascurso fermentativo normal esté representada por el género Saccharomyces y más particularmente por S. cerevisiae; este fenómeno se debe a la capacidad congénita de la especie en cuestión para resistir altas concentraciones de alcohol, incluso superiores al 12% ABV, donde en cambio la mayoría de las especies contaminantes son inhibidas por estos valores.
- En consecuencia, el estado microbiológico final de la fermentación no da ninguna indicación de su «historia» real. En otras palabras, aunque la concentración alcohólica del medio favorece una sobrerrepresentación final del iniciador inoculado, los eventos que involucran las primeras fases de fermentación siguen siendo de hecho desconocidos. Esta ventana de falta de control microbiológico podría permitir la aparición de defectos cualitativos relacionados con el metabolismo de especies no seleccionadas.
- A diferencia de la aplicación de la LSA, no existe garantía sobre el número total de células inoculadas al inicio de la fermentación, que, salvo la posibilidad de medirlas con métodos como la cámara de Bürker o contarlas en medios tipo agar (disponible sólo para bodegas con laboratorios internos altamente especializados), sigue siendo totalmente inverificable. El mismo problema afecta a la imposibilidad de verificar la pureza microbiológica de la población final obtenible del proceso de propagación.
- La selección de cepas de levadura en ambientes de bodega plantea muchas dificultades de gestión. No sólo sería necesario un equipo de laboratorio microbiológico, para realizar la manipulación de la cepa (placas, campanas estériles, autoclaves de esterilización), sino que los límites máximos los fijaría la conservación a largo plazo, para garantizar la conservación de las características fenotípicas en el stock original será necesario congelar a -80°C en solución de glicerol al 25%. Esta tecnología, inviable en la bodega, es en cambio prerrogativa de las colecciones microbianas, que pueden realizar controles genéticos periódicos de las células y, por tanto, controlar su estado cualitativo,
- Las levaduras colocadas en tales multiplicadores no se multiplican utilizando melazas y nutrientes nitrogenados estériles; por el contrario, se alimentan con mosto de uva o con MCR, lo que predispone a la aparición de contaminaciones derivadas de las mismas materias primas.
- Un punto final pero fundamental relacionado con el uso de multiplicadores de biomasa es el relativo a la posible aparición de mutaciones genéticas en levaduras. Esto sucede por una razón bastante simple e intuitiva: un microorganismo que crece en un caldo de cultivo de forma perpetua (incluso asumiendo un 3% del ABV y un pH controlado de 4.5), en realidad no está sujeto a ninguna presión selectiva. Por esta razón, la funcionalidad de genes que no son «esenciales» para su reproducción en este ambiente puede perderse sin dañar la aptitud de la cepa, que en cambio se beneficiará de la selección positiva de variantes alélicas que favorezcan la cinética de crecimiento y el uso eficiente de nutrientes en un metabolismo respiratorio en lugar de fermentativo. De la misma forma, la cepa en cuestión podría perder funcionalidad relacionada con las características originales por las que fue seleccionada en primera instancia, como una determinada huella aromática o una actividad enzimática, o bien desarrollar alteraciones en el metabolismo que puedan predisponerla a un mayor estrés, en particular condiciones nutricionales o incluso producir niveles más altos de acidez volátil.
Las precauciones que deben adoptarse
El aspecto engañoso de la aplicación de técnicas de multiplicación «artesanales» es que, de cualquier forma, ya sea que se utilicen o no los métodos correctos, conducirán a algún resultado de cualquier tipo. Siempre habrá fermentación del medio y por ello producción de una población de células, de las que no sabremos, sin embargo, la extensión o el grado de pureza microbiológica.
Por tanto, la propagación de levaduras enológicas mediante el uso de multiplicadores como los descritos anteriormente no puede en modo alguno ignorar el uso de la LSA, que, incluso en este contexto, deberían utilizarse (en una buena práctica) para realizar una restauración periódica de la integridad genética original de la cepa.
En resumen, la adopción de procesos de propagación de biomasa en el interior de las bodegas, si no se realiza con las debidas precauciones técnicas (reducción de la carga microbiana del caldo de cultivo, reintegración periódica de la población de las levaduras con LSA), corre el riesgo de producir efectos adversos y traicioneros, la misma razón por la que se han implementado los starters enológicos.
Si se pretende emprender este tipo de aplicaciones en bodega, es necesario realizar diversos esfuerzos en cuanto a detergencia, desinfección y control de las variables del proceso (temperatura, pH, agitación, vitalidad celular) y desconfiar categóricamente de cualquier acercamiento simple a la multiplicación de la biomasa, que requiere en cambio un fino aporte de alto contenido biotecnológico, con pérdida, ya a medio plazo de las características de calidad y reproducibilidad del proceso de fermentación.
Fuente: https://www.aeb-group.com/ar/enologia/gama-fermentacion
