{"id":92434,"date":"2023-05-13T13:58:58","date_gmt":"2023-05-13T13:58:58","guid":{"rendered":"https:\/\/enolife.com.ar\/es\/?p=92434"},"modified":"2023-05-19T23:49:36","modified_gmt":"2023-05-19T23:49:36","slug":"usan-bacterias-enologicas-seleccionadas-para-el-biocontrol-de-hongos-brettanomyces-en-el-vino","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/enolife.com.ar\/es\/usan-bacterias-enologicas-seleccionadas-para-el-biocontrol-de-hongos-brettanomyces-en-el-vino\/","title":{"rendered":"Usan bacterias enol\u00f3gicas seleccionadas para el biocontrol de hongos brettanomyces en el vino"},"content":{"rendered":"\n

En la actualidad existe una voluntad cada vez mayor de reducir el uso de productos qu\u00edmicos en la elaboraci\u00f3n del vino, entre ellos el di\u00f3xido de azufre (SO2), que a\u00fan sigue siendo una herramienta excelente para reducir la poblaci\u00f3n de contaminantes durante todo el proceso de vinificaci\u00f3n, como son las Brettanomyces. En el siguiente art\u00edculo, la empresa de levaduras enol\u00f3gicas Lallemand propone reemplazar el uso de qu\u00edmicos para el biocontrol de microorganismos contaminantes utilizando -en coinoculaci\u00f3n o en inoculaci\u00f3n secuencial- una bacteria enol\u00f3gica seleccionada, lo que ha demostrado ser una opci\u00f3n biol\u00f3gica segura para los en\u00f3logos. <\/strong><\/em><\/h4>\n\n\n\n
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\u00bfQu\u00e9 es el biocontrol?<\/strong><\/p>\n\n\n\n

El concepto de control biol\u00f3gico o protecci\u00f3n, tambi\u00e9n llamado \u00abbiocontrol\u00bb<\/strong> es un m\u00e9todo conocido y aplicado desde los inicios de la agricultura, incluso antes de que fu\u00e9ramos concientes de su existencia. El desarrollo de la agricultura estaba inevitablemente vinculado con la necesidad de proteger los cultivos por medio de diversos m\u00e9todos, incluido el biocontrol. <\/p>\n\n\n\n

Durante muchos a\u00f1os, con el desarrollo de la qu\u00edmica aplicada al sector de la agroalimentaci\u00f3n, se dejaron de lado los instrumentos de control biol\u00f3gico. Debido a la creciente sensibilizaci\u00f3n por las cuestiones medioambientales y sanitarias derivadas del uso de las sustancias qu\u00edmicas, se volvi\u00f3 a prestar de nuevo atenci\u00f3n a los m\u00e9todos alternativos tales como el biocontrol, con un conocimiento mejorado y con un enfoque cient\u00edfico. El biocontrol parece haberse revelado como un gran v\u00eda natural para proteger los cultivos contra plagas y enfermedades. <\/p>\n\n\n\n

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\u00bfD\u00f3nde se origina?<\/strong><\/p>\n\n\n\n

El principio del biocontrol se basa en la gesti\u00f3n del equilibrio de las poblaciones negativas
m\u00e1s que en su erradicaci\u00f3n. Los instrumentos de biocontrol fomentan el uso de mecanismos naturales y las interacciones de las relaciones entre las especies en un medio.<\/p>\n\n\n\n

En la elaboraci\u00f3n de alimentos, la preservaci\u00f3n de estos con la flora protectora es un concepto que tiene m\u00e1s de 40 a\u00f1os de antig\u00fcedad. El objetivo consist\u00eda en alargar su vida \u00fatil y limitar los riesgos de la contaminaci\u00f3n microbiol\u00f3gica: una gran alternativa a los conservantes qu\u00edmicos. Ahora son varios los campos de aplicaci\u00f3n y podemos encontrar mecanismos de biocontrol en el queso, el pan, las bebidas, etc\u00e9tera.<\/p>\n\n\n\n

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Biocontrol para mejorar la calidad del vino<\/strong><\/p>\n\n\n\n

En el vino, el uso del di\u00f3xido de azufre (SO2)<\/strong> supuso una mejora sorprendente en lo que a la calidad del producto se refiere, sobre todo debido a su actividad antif\u00fangica y antibacteriana.<\/strong> Pero hoy en d\u00eda existe una voluntad cada vez mayor de reducir el uso de productos qu\u00edmicos en la elaboraci\u00f3n del vino y, evidentemente, el SO2 es uno de ellos. Sigue siendo una herramienta excelente para reducir la poblaci\u00f3n de contaminantes durante todo el proceso de vinificaci\u00f3n, como la flora de levadura oxidativa, bacterias contaminantes y por supuesto, Brettanomyces, que todav\u00eda es considerado como el enemigo n\u00famero uno del vino. <\/p>\n\n\n\n

Sin embargo, estudios recientes (Curtin et al. 2012; Vigentini et al. 2013; Alberti et al. 2017) mostraron la existencia de una gran diversidad gen\u00e9tica en los Brettanomyces y entre ellas hay un n\u00famero significativo de cepas de brettanomyces bruxellensis capaces de resistir y sobrevivir al SO2 (figura 1). AWRI (Curtin et al 2012) demostraron que el 85% de la poblaci\u00f3n de Brettanomyces de su estudio era capaz de sobrevivir y crecer a 0,6 mg\/L de de SO2 molecular. Albertin et al (en 2016) identificaron el 34% de cepas B. bruxellensis, entre un grupo de 33 cepas, como altamente resistentes al SO2 resistant.<\/p>\n\n\n\n

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Figura 1. Tolerancia de diferentes Brettanomyces bruxellensis a los sulfitos Aislamientos australianos (por Curtin et al. 2012).<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n
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\u00bfSe pueden utilizar las bacterias seleccionadas para biocontrol?<\/strong><\/p>\n\n\n\n

Este tipo de resistencia dar\u00eda lugar a niveles de SO2 final muy altos en los vinos para lograr el nivel letal necesario para erradicar semejante poblaci\u00f3n de Brettanomyces. Esos resultados revelan los l\u00edmites de SO2 como un mecanismo de control de Brettanomyces y ponen de relieve la necesidad de unos instrumentos de biocontrol alternativos para gestionar este riesgo. <\/p>\n\n\n\n

La inoculaci\u00f3n temprana de levaduras (Gerbaux et al., 2004) ya est\u00e1 reconocida como un mecanismo de biocontrol muy eficiente contra el desarrollo de Brettanomyces. M\u00e1s recientemente se ha descubierto que hay bacterias enol\u00f3gicas seleccionadas eficaces que se pueden considerar tambi\u00e9n como un instrumento efectivo de biocontrol para gestionar la contaminaci\u00f3n por Brettanomyces y los niveles de fenoles vol\u00e1tiles del vino. Estos compuestos vol\u00e1tiles, sobre todo 4-etil-guaiacol (4-EG) y 4-etil-fenol (4-EF), son los responsables de aromas no deseados en los vinos. La inoculaci\u00f3n apropiada de bacterias enol\u00f3gicas seleccionadas tambi\u00e9n est\u00e1 reconocida por la Organizaci\u00f3n Internacional de la Vid y el Vino (Resoluci\u00f3n OIV-OENO 462-2014) <\/strong>como una pr\u00e1ctica para reducir el crecimiento de Brettanomyces durante la vinificaci\u00f3n. Se ha descubierto que hay determinadas bacterias enol\u00f3gicas que est\u00e1n consideradas como instrumentos de biocontrol eficientes contra los microorganismos contaminantes para proteger la calidad del vino.<\/p>\n\n\n\n

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Los resultados<\/strong><\/p>\n\n\n\n

Biocontrol con bacterias enol\u00f3gicas seleccionadas para combatir el desarrollo de brettanomyces <\/strong><\/p>\n\n\n\n

Estudios previos mostraron el claro impacto de la inoculaci\u00f3n temprana con BML en la reducci\u00f3n de los niveles finales de fenoles vol\u00e1tiles (Gerbaux et al. 2009; Pillet et al. 2011). Es bien sabido que el per\u00edodo comprendido entre el final de la fermentaci\u00f3n alcoh\u00f3lica y el comienzo de la fermentaci\u00f3n malol\u00e1ctica (FML) es cr\u00edtico para los microorganismos contaminantes tales como ciertas especies de bacterias y Brettanomyces. <\/p>\n\n\n\n

En 2014, la OIV reconoci\u00f3 que la coinoculaci\u00f3n con levaduras y bacterias l\u00e1cticas seleccionadas podr\u00eda ayudar a reducir esta fase de latencia y limitar, en consecuencia, el desarrollo de Brettanomyces. Los \u00faltimos proyectos de investigaci\u00f3n han estudiado si adem\u00e1s de reducir esta fase de latencia, algunas bacterias seleccionadas podr\u00edan inhibir directamente el crecimiento de las Brettanomyces. <\/p>\n\n\n\n

Las investigaciones llevadas a cabo en colaboraci\u00f3n con el IFV de Borgo\u00f1a en 2015 y 2016 en Pinot mostraron las din\u00e1micas de la poblaci\u00f3n de microorganismos en los vinos inoculados justo despu\u00e9s de la fermentaci\u00f3n alcoh\u00f3lica con Brettanomyces (103 CFU\/mL en 2015 ; 102 CFU\/mL en 2016) y despu\u00e9s con distintas bacterias seleccionadas (1g\/hL) a una temperatura de entre 16 y 18\u00b0C.<\/p>\n\n\n\n

Los resultados mostraron que hab\u00eda una clara inhibici\u00f3n del crecimiento de Brettanomyces por las bacterias seleccionadas para ambas a\u00f1adas. En la figura 2 podemos apreciar la medidas de la poblaci\u00f3n de Brettanomyces en 2016 con 3 diferentes bacterias seleccionadas en comparaci\u00f3n con el control, donde no se inocul\u00f3 ninguna bacteria y en la que la FML ocurr\u00eda de manera espont\u00e1nea. Los resultados fueron los mismos cuando las Brettanomyces eran de 103 cfu\/mL.<\/p>\n\n\n\n

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Figura 2. Biocontrol de poblaci\u00f3n de Brettanomyces con varias bacterias enol\u00f3gicas seleccionadas.<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n
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La inoculaci\u00f3n y el desarrollo de estas 3 bacterias seleccionadas limitaron significativamente el desarrollo de Brettanomyces a\u00fan siendo fuerte la contaminaci\u00f3n de Brettanomyces al principio. Los niveles finales de Brettanomyces en presencia de la bacteria seleccionada era m\u00e1s o menos el mismo que al principio (entre 102 y 103 ufc\/mL) mientras que en el control con las bacterias ind\u00edgenas (FML espont\u00e1nea), el nivel final de Brettanomyces era mucho m\u00e1s alto (105 ) con un pico de 106 ufc\/mL, i.e. 106 ufc\/mL (una diferencia de 2 a 4 log). <\/p>\n\n\n\n

Se midieron los fenoles vol\u00e1tiles en todos los tratamientos al final del experimento (figura 3) y el vino en el que la FML se realiz\u00f3 espont\u00e1neamente mostr\u00f3 niveles altos tanto de 4-etil-fenol y 4-etil-guaiacol, por encima del umbral de percepci\u00f3n, mientras que los vinos en los que se inocul\u00f3 las bacterias seleccionada tuvieron niveles muy bajos de los dos fenoles, muy pr\u00f3ximos a cero.<\/p>\n\n\n\n

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Figura 3. Biocontrol de Brettanomyces con inoculaci\u00f3n de bacterias seleccionadas. Impacto en la producci\u00f3n de fenoles vol\u00e1tiles<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n
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Estas diferencias en los fenoles vol\u00e1tiles est\u00e1n claramente relacionadas con las diferencias de poblaci\u00f3n y muestran, una vez m\u00e1s, la verdadera ventaja de un biocontrol de Brettanomyces por medio de la inoculaci\u00f3n de algunas bacterias seleccionadas, tambi\u00e9n en la calidad del vino.<\/p>\n\n\n\n

Este trabajo fue ratificado por otro estudio en 2016 en pinot noir. Se utilizaron cuatro bacterias diferentes en la coinoculaci\u00f3n (24 horas despu\u00e9s de la inoculaci\u00f3n con levaduras) en un mosto inicialmente contaminado con Brettanomyces en 1.7 x103 ufc\/mL. La FML finaliz\u00f3 en 20-40 d\u00edas mientras que la del control inoculado acab\u00f3 pasados los 60 d\u00edas.<\/p>\n\n\n\n

Las figuras 4a y 4b ilustran la evoluci\u00f3n de la poblaci\u00f3n de Brettanomyces y de las bacterias: la primera, el caso de coinoculaci\u00f3n con bacterias seleccionadas (fig 4a: los resultados mostrados son una media de todos los tratamientos con la bacteria seleccionada) y la segunda, el caso del control – espont\u00e1nea (fig 4b). Podemos ver claramente en la figura 4a que no hay desarrollo de poblaci\u00f3n de Brettanomyces (incluso con esta fuerte contaminaci\u00f3n) y que esta poblaci\u00f3n contaminante desciende de principio a fin, en contraposici\u00f3n a la poblaci\u00f3n de bacterias seleccionadas, que al mismo tiempo sigue creciendo. <\/p>\n\n\n\n

Por el contrario, en la figura 4b, la poblaci\u00f3n de Brettanomyces se mantiene en niveles altos hasta el d\u00eda 11 (fecha del trasiego) y hay un nuevo crecimiento debido a lento desarrollo de la poblaci\u00f3n de bacterias espont\u00e1neas. Los niveles finales son significativamente diferentes entre los vinos con coinoculaci\u00f3n y el control: hay 10 veces m\u00e1s Brettanomyces en el control que en el coinocualdo (m\u00e1s de un log ufc\/mL de diferencia). Esos resultados confirman la fuerte competencia entre nuestra bacteria seleccionada y una poblaci\u00f3n de levaduras contaminantes como son las Brettanomyces, especialmente en coinoculaci\u00f3n gracias a un crecimiento m\u00e1s f\u00e1cil de bacterias seleccionadas y una excelente capacidad de supervivencia de esas bacterias.<\/p>\n\n\n\n

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Fig. 4a (izq): Seguimiento de poblaci\u00f3n de Brettanomyces y de bacterias. Coinoculaci\u00f3n con bacterias seleccionadas
Fig. 4b (der): Seguimiento de poblaci\u00f3n de Brettanomyces y de bacterias. Control sin inoculaci\u00f3n de bacterias<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n
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Biocontrol con ciertas bacterias seleccionadas para combatir la liberaci\u00f3n de precursores de aromas no deseados <\/strong><\/p>\n\n\n\n

Con las Brettanomyces, se produce 4-etil-guaiacol (4-EG) y 4-etil-fenol (4-EP) durante la biotransformaci\u00f3n de los \u00e1cidos hidroxicin\u00e1micos, \u00e1cido p-cum\u00e1rico y \u00e1cido fer\u00falico, que son precursores que est\u00e1n presentes de manera natural en la uvas, ya sea de forma ligada o libre. La transformaci\u00f3n de estos tres precursores en 4-EG y 4-EP (figura 5) se da en dos pasos: primero con la enzima cinamato decarboxilasa, seguido de la enzima vinilfenol reductasa. Pero antes de que las Brettanomyces puedan usar esos precursores, deben liberarse de su forma ligada en su forma libre por medio de la acci\u00f3n de la cinamil esterasa.<\/p>\n\n\n\n

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Figura 5. Pasos en la producci\u00f3n de etil fenoles.<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n
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Algunas bacterias l\u00e1cticas, incluida Oenococcus oeni, tienen esta actividad enzim\u00e1tica de la cinamil esterasa y podr\u00edan por tanto aumentar la cantidad de los precursores libres, haciendo que puedan ser usados por las Brettanomyces para producir fenoles vol\u00e1tiles (Burns and Osborne 2013). Sus resultados demostraron que dependiendo de la bacteria enol\u00f3gica utilizada para la FML, se generaba una concentraci\u00f3n distinta de precursores libres. <\/p>\n\n\n\n

Esto significa que, cuando se utiliza una bacteria enol\u00f3gica, ha de ser cinamil esterasa negativa para evitar la producci\u00f3n de precursores de fenoles vol\u00e1tiles que puedan ser de utilizados por las Brettanomyces. <\/p>\n\n\n\n

Todas las bacterias enol\u00f3gicas de Lallemand han sido probadas y la empresa asegura que todas ellas son fenol negativas tal y como se demuestra en la figura 6, seg\u00fan un estudio realizado por J.Osborne (OSU).<\/p>\n\n\n\n

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Figura 6. Impacto en la producci\u00f3n de fenoles vol\u00e1tiles en funci\u00f3n de la bacteria seleccionada inoculada.<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n
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Conclusiones<\/strong><\/p>\n\n\n\n

El biocontrol de microorganismos contaminantes con determinadas bacterias enol\u00f3gicas seleccionadas constituye una opci\u00f3n biol\u00f3gica segura para los en\u00f3logos. Con la gesti\u00f3n cuidadosa de la fermentaci\u00f3n alcoh\u00f3lica con levaduras adecuadamente rehidratadas y nutridas as\u00ed como con el uso en coinoculaci\u00f3n o en inoculaci\u00f3n secuencial de una bacteria enol\u00f3gica seleccionada, se controla mejor la poblaci\u00f3n de Brettanomyces, y consecuentemente, la producci\u00f3n de aromas fenolados no deseados. Cuando el nivel de contaminaci\u00f3n por Brettanomyces es alto, se recomienda la coinoculaci\u00f3n puesto que as\u00ed el biocontrol empezar\u00e1 justo al principio de la fermentaci\u00f3n. <\/p>\n\n\n\n

Adem\u00e1s, las bacterias enol\u00f3gicas de Lallemand han demostrado ser fenol negativas y no pueden proporcionar a las Brettanomyces precursores para producir aromas no deseados, 4-etil-fenol y 4-etil-guaiacol. El biocontrol por medio de la protecci\u00f3n con nuestras bacterias enol\u00f3gicas seleccionadas, junto con el hecho de privar a las Brettanoymces de sus precursores, es la f\u00f3rmula ganadora para respetar la tipicidad del vino para que se pueda expresar libremente y sin defectos caracter\u00edsticos del \u00abBrett\u00bb.<\/p>\n\n\n\n

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Un problema identificado a partir de 1980<\/strong><\/p>\n\n\n

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Vincent Gerbaux<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n

Seg\u00fan nos explica el bi\u00f3logo franc\u00e9s Vincent Gerbaux<\/strong>, la levadura Brettanomyces siempre ha estado asociada con el vino. As\u00ed lo relata: \u00abUn poema escrito durante la Primera Guerra Mundial (Marc Leclerc, 1915) dec\u00eda \u00abHola vino de la casa de los cuarteles, Que sabe a muy poco o nada, Salvo los d\u00edas en los que sol\u00edas apestar a fenoles o abono\u2026.\u00bb. Pero la implicaci\u00f3n de las Brettanomyces en la producci\u00f3n de fenoles vol\u00e1tiles en los vinos y el hecho de que esto se reconozca como un problema, data reci\u00e9n de 1980.<\/em>\u00ab<\/p>\n\n\n\n

Y detalla el experto: \u00abLas \u00faltimas investigaciones reducen el umbral de percepci\u00f3n de los fenoles vol\u00e1tiles a unos 200 \u03bcg\/L, un valor que alcanza con facilidad la contaminaci\u00f3n por Brettanomyces. Esta levadura posee una notable habilidad para adaptarse a condiciones fisicoqu\u00edmicas desfavorables. Las brettanomyces se pueden multiplicar tanto durante la maceraci\u00f3n, en presencia de az\u00facares, como en botella, despu\u00e9s de varios a\u00f1os de almacenamiento de un vino seco. Diferentes estudios muestran que las bodegas contienen una amplia biodiversidad de Brettanomyces\u00bb.<\/em><\/p>\n\n\n\n

\u00abLa mejor manera de controlarlas<\/em> -ense\u00f1a Gerbaux- consiste en una buena higiene, el uso del control microbiol\u00f3gico y el control de las fermentaciones. El control de la fermentaci\u00f3n malol\u00e1ctica es un punto crucial en esta batalla. La inoculaci\u00f3n con bacterias enol\u00f3gicas seleccionadas proporciona diferentes soluciones para el control de la FML. Dependiendo de la antig\u00fcedad del lugar y el riesgo de ocurrencia de los fenoles vol\u00e1tiles, la FML puede ser o bien muy r\u00e1pida si se considera la inoculaci\u00f3n con levaduras\/bacterias o lenta si se hace con una inoculaci\u00f3n bacteriana lenta asociada con baja temperatura. Estas diferentes opciones deben permitir la finalizaci\u00f3n de la FML antes de que se observe un crecimiento problem\u00e1tico de Brettanomyces. Entonces se puede estabilizar el vino con un sulfitado convencional o con un compuesto complementario o alternativo, el quitosano. Tras la FML, el crecimiento de Brettanomyces, aunque a\u00fan siga siendo efectivo, en ese momento es menos r\u00e1pido y menos importante que lo que hab\u00eda ido antes de la FML\u00bb.<\/em><\/p>\n\n\n\n

\u00abLa inducci\u00f3n de la FML por medio de la inoculaci\u00f3n trae consigo una gran poblaci\u00f3n de bacterias enol\u00f3gicas que ejerce efectos negativos directos en el desarrollo de Brettanomyces\u00bb<\/em>, concluye el bi\u00f3logo.<\/p>\n\n\n\n

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Vincent Gerbaux:<\/strong> Licenciado por la Ensbana (actualmente, AgroSup Dijon), M\u00e1ster en Biolog\u00eda aplicada a la Nutrici\u00f3n y a la Alimentaci\u00f3n y licenciado en Enolog\u00eda en 1983. En la tesis que present\u00f3 en la Universidad de Dijon (1983 a 1985) realiz\u00f3 un estudio sobre las bacterias acido l\u00e1cticas en el vino. En 1985, empez\u00f3 a trabajar para el IFV en Burdeos y tres a\u00f1os despu\u00e9s, en el de Beaune.

Actualmente est\u00e1 a cargo del proyecto \u00abTechnoferm\u00bb del IFV, reuniendo todos los estudios sobre fermentaciones alcoh\u00f3licas y malol\u00e1cticas. Colaborando desde hace a\u00f1os con Lallemand, ha seleccionado y caracterizado cepas originales de Oenococcus oeni que se comercializan actualmente. Desde hace cinco a\u00f1os, dirige los estudios sobre la selecci\u00f3n de cepas de Saccharomyces y No-Saccharomyces para aplicaciones tecnol\u00f3gicas espec\u00edficas. Al mismo tiempo, su equipo tambi\u00e9n est\u00e1 trabajando en los microorganismos contaminantes en el vino, especialmente las Brettanomyces.<\/p>\n\n\n\n

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