{"id":73502,"date":"2022-09-02T16:46:27","date_gmt":"2022-09-02T16:46:27","guid":{"rendered":"http:\/\/enolife.com.ar\/es\/?p=73502"},"modified":"2022-09-06T21:41:51","modified_gmt":"2022-09-06T21:41:51","slug":"quitosano-de-origen-fungico-una-herramienta-natural-contra-el-defecto-brettanomyces-en-el-vino","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/enolife.com.ar\/es\/quitosano-de-origen-fungico-una-herramienta-natural-contra-el-defecto-brettanomyces-en-el-vino\/","title":{"rendered":"Quitosano de origen f\u00fangico, una herramienta natural contra el defecto brettanomyces en el vino"},"content":{"rendered":"\n

La levadura contaminante brettanomyces bruxellensis constituye una amenaza permanente para la calidad de los vinos. Estas levaduras son capaces de desarrollarse en cualquier momento de la vida de un vino, particularmente durante la fase de crianza. Actualmente, para luchar contra la brettanomyces (com\u00fanmente llamada \u00abbret\u00bb o \u00abbrett\u00bb) se utilizan diferentes medios con mayor o menor \u00e9xito, pero no suficientes, pues no existe herramienta totalmente satisfactoria para eliminar estos microorganismos alterantes. <\/strong><\/em><\/h4>\n\n\n\n
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En esta nota de divulgaci\u00f3n enol\u00f3gica, el investigador espa\u00f1ol Jos\u00e9 Mar\u00eda Heras propone el uso de la sustancia quitosano de origen f\u00fangico, en una formulaci\u00f3n innovadora de Lallemand, para combatir este defecto indeseable, por sus propiedades no alerg\u00e9nicas, de origen natural y sin impacto negativo en la calidad sensorial del vino.<\/strong><\/em> <\/h4>\n\n\n\n
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Por Jos\u00e9 Mar\u00eda Heras<\/strong>
(Director t\u00e9cnico de I+D y Enolog\u00eda en Lallemand Enolog\u00eda, Espa\u00f1a) <\/em><\/p>\n\n\n\n

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Admitido como pr\u00e1ctica enol\u00f3gica por la Organizaci\u00f3n Internacional de la Vid y el Vino (OIV)<\/strong> en julio de 2009 y por la Uni\u00f3n Europea (UE) <\/strong>en diciembre de 2010, el quitosano de origen f\u00fangico<\/strong> representa una herramienta innovadora y eficaz de lucha contra la brettanomyces. Varios trabajos llevados a cabo en laboratorio mostraban la eficacia del quitosano, y desde 2008, experiencias en condiciones reales de bodega confirman su efectividad en muy diversas condiciones. <\/p>\n\n\n\n

Todo el conocimiento adquirido a partir de los resultados de estas experiencias han ayudado a los en\u00f3logos a refinar sus m\u00e9todos para monitorizar la efectividad del tratamiento, y han contribuido a comprender el modo de acci\u00f3n del quitosano sobre las c\u00e9lulas de la brettanomyces.<\/p>\n\n\n\n

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Origen del quitosano utilizado en enolog\u00eda<\/strong><\/p>\n\n\n\n

El quitosano es una mol\u00e9cula derivada de la quitina<\/strong>. La quitina y el quitosano se encuentran entre los pol\u00edmeros de origen natural m\u00e1s extendidos en la Tierra, solo superados por la celulosa. La quitina se encuentra especialmente en los exoesqueletos de los crust\u00e1ceos e insectos, as\u00ed como en la pared celular de ciertos hongos.<\/p>\n\n\n\n

Un derivado desacetilado de quitina, el quitosano<\/strong>, es un copol\u00edmero \u03b2-1-4 lineal de N-acetil D-glucosamina y D-glucosamina (fig. 1), obtenida por hidr\u00f3lisis de los grupos acetilo (CH3-CO). Esta operaci\u00f3n libera los grupos amino primarios (R-NH2) y confiere una naturaleza \u00abcati\u00f3nica\u00bb al quitosano.<\/p>\n\n\n\n

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Figura 1: Quitosano, pol\u00edmero derivado de la quitina por desacetilaci\u00f3n.<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n\n
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De hecho, no hay s\u00f3lo uno sino varios quitosanos, ya que las variaciones en el grado de desacetilaci\u00f3n, el peso molecular y la preparaci\u00f3n de las formulaciones (granulometr\u00eda, en particular) dan como resultado mol\u00e9culas con propiedades y acciones variadas.<\/p>\n\n\n\n

La innovaci\u00f3n que llev\u00f3 a recibir la aprobaci\u00f3n para el uso de quitosano en enolog\u00eda es el proceso para obtener quitina de una fuente f\u00fangica no animal, el hongo aspergillus niger<\/strong>. Este proceso, patentado por Kitozyme<\/strong>, proporciona una fuente natural de quitosano que es biodegradable y no alerg\u00e9nica.<\/strong><\/p>\n\n\n\n

Las propiedades antibacterianas y antif\u00fangicas del quitosano han sido ampliamente estudiadas y documentadas y hoy son bien reconocidas. Numerosos estudios demostraban la acci\u00f3n antimicrobiana de este pol\u00edmero frente a bacterias diversas y pat\u00f3genos, pero igualmente sobre ciertos hongos de la vid como Botrytis<\/strong> (1).<\/em> Sin embargo, \u00fanicamente en un estudio de G\u00f3mez-Rivas<\/strong> publicado en 2004 (2)<\/em>, se hac\u00eda referencia al inter\u00e9s del quitosano en medios fermentativos y, m\u00e1s particularmente, para la inhibici\u00f3n del crecimiento de brettanomyces.<\/p>\n\n\n\n

Bornet y Teisseidre<\/strong> (3)<\/em> investigaron las propiedades enol\u00f3gicas del quitosano, especialmente en relaci\u00f3n con brettanomyces bruxellensis,<\/strong> primero en el laboratorio y luego en vinos de Languedoc-Rosell\u00f3n<\/strong> (4).<\/em> Diez d\u00edas despu\u00e9s del tratamiento con quitosano a una dosis de 4 g\/hL, las poblaciones de brettanomyces en vinos contaminados fueron generalmente no detectadas en medios de cultivo selectivos. Al mismo tiempo, los mismos vinos, sin tratar, a menudo mostraban aumento o mantenimiento de poblaciones contaminantes. Por lo tanto, la efectividad del quitosano, espec\u00edficamente en la lucha contra brettanomyces bruxellensis en vino, se demostr\u00f3 claramente.<\/p>\n\n\n\n

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Modo de acci\u00f3n sobre brettanomyces<\/strong><\/p>\n\n\n\n

Los estudios llevados a cabo en el 2011 por el INP-Ensiacet de Toulouse, Francia<\/strong>, dirigidos por Patricia Taillandier<\/strong> (5),<\/em> ten\u00edan como objetivo ampliar el conocimiento sobre el modo de acci\u00f3n del quitosano y el origen de la inhibici\u00f3n del crecimiento de brettanomyces en el vino.<\/p>\n\n\n\n

Se llevaron a cabo experimentaciones sobre medio sint\u00e9tico con el fin de controlar bien la composici\u00f3n (\u00e1cido tart\u00e1rico 3 g\/L; glicerina 6 g\/L; etanol 13 % v\/v; pH 3,7; brettanomyces 106 c\u00e9lulas\/mL). La acci\u00f3n letal del quitosano fue analizada por citometr\u00eda de flujo en el tiempo posterior a la introducci\u00f3n del quitosano (T0, T5horas y T24horas) en comparaci\u00f3n con una modalidad control que no fue sometida a ning\u00fan tratamiento.<\/p>\n\n\n\n

La citometr\u00eda de flujo permite diferenciar las c\u00e9lulas muertas y las c\u00e9lulas vivas. As\u00ed como lo demuestra la figura 2, en medio sint\u00e9tico, la acci\u00f3n letal del quitosano frente a brettanomyces es r\u00e1pida. A la dosis de 4 g\/hL, 5 horas bastan para ver un efecto letal sobre el 60 % de la poblaci\u00f3n de brettanomyces presente en el medio sint\u00e9tico.<\/p>\n\n\n\n

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Figura 2: Seguimiento por citometr\u00eda de flujo de la evoluci\u00f3n de la mortalidad de Brettanomyces en el tiempo estudiado.<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n\n
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Este estudio permiti\u00f3 tambi\u00e9n demostrar que el quitosano ten\u00eda igualmente un efecto biol\u00f3gico frente a brettanomyces. En este sentido se realizaron medidas de flujo de ATP intracelular durante las dos horas comparando una modalidad control (ausencia de quitosano en el medio sint\u00e9tico + brettanomyces 18 x 106 c\u00e9lulas\/mL) y una modalidad tratamiento (presencia de quitosano a la dosis de 10 g\/hL en el medio sint\u00e9tico + brettanomyces 18 x 106 c\u00e9lulas\/mL).<\/p>\n\n\n\n

Se puede observar en la figura 3 que la presencia de quitosano genera una liberaci\u00f3n del ATP en el medio. Este fen\u00f3meno se traduce en una perturbaci\u00f3n fuerte de la permeabilidad de la membrana de brettanomyces muy probablemente correlacionada a la mortalidad de brettanomyces observada.<\/p>\n\n\n\n

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Figura 3: Seguimiento de la evoluci\u00f3n del flujo de ATP de Brettanomyces en el tiempo en presencia de quitosano 10g\/hL (rojo) y sin quitosano (azul).<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n\n
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Durante este trabajo, se demostr\u00f3 igualmente el efecto f\u00edsico que el quitosano ten\u00eda frente a las c\u00e9lulas de brettanomyces. Como muestran las fotos de observaci\u00f3n de microscopia cl\u00e1sica (fig. 4A) y de microscopia electr\u00f3nica (fig. 4B), el quitosano y brettanomyces se agregan, gracias muy probablemente a interacciones de carga, lo que provoca la sedimentaci\u00f3n de las c\u00e9lulas de brettanomyces. En efecto, al pH en el que se realizaron los estudios, pH del vino, el quitosano est\u00e1 cargado positivamente, mientras que la superficie de la levadura brettanomyces est\u00e1 cargada negativamente.<\/p>\n\n\n\n

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Figura 4: Observaci\u00f3n de Brettanomyces tratados con quitosano.<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n\n
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Estudios m\u00e1s recientes, donde se comparaban diferentes t\u00e9cnicas de detecci\u00f3n mediante t\u00e9cnicas de biolog\u00eda molecular, han contrastado el efecto letal del quitosano sobre las c\u00e9lulas de brettanomyces. A partir de una muestra de vino (procedente de bodega), se realiz\u00f3 el an\u00e1lisis de la poblaci\u00f3n de brettanomyces por RT-PCRPMAX (PCR en tiempo real con PMAX<\/strong> seg\u00fan t\u00e9cnica adoptada por Laboratorios Excell Ib\u00e9rica<\/strong>, 2017). <\/p>\n\n\n\n

Esta t\u00e9cnica permite cuantificar de manera exclusiva las c\u00e9lulas vivas que no han sufrido da\u00f1o en su estructura celular. PMAX es una tecnolog\u00eda de doble tinte desarrollada por GenIUL<\/strong>. Combinando ambos tintes, se neutralizar\u00e1 el DNA de las c\u00e9lulas muertas (con membranas da\u00f1adas o no da\u00f1adas); por lo tanto, solo se detectar\u00e1 DNA de c\u00e9lulas vivas. Este producto es muy efectivo para eliminar la amplificaci\u00f3n por PCR del DNA de c\u00e9lulas muertas y proporcionar la mejor discriminaci\u00f3n entre bacterias vivas y muertas.<\/p>\n\n\n\n

As\u00ed, a partir de una poblaci\u00f3n inicial de 1,5 x 103 c\u00e9lulas\/mL, se llev\u00f3 a cabo la aplicaci\u00f3n de quitosano a la dosis de 4 g\/hL, analizando las c\u00e9lulas vivas a los 5 y 20 d\u00edas posteriores al tratamiento. Se puede observar en la figura 5 un efecto letal sobre las c\u00e9lulas a los 5 d\u00edas, que se mantiene a los 20 en relaci\u00f3n con el vino control utilizado como testigo.<\/p>\n\n\n\n

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Figura 5: Seguimiento por RT PCRPMAX de la evoluci\u00f3n de las c\u00e9lulas vivas de Brettanomyces en el tiempo estudiado.<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n\n
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En conclusi\u00f3n, todos estos estudios permitieron demostrar que el quitosano ten\u00eda dos efectos complementarios frente a las c\u00e9lulas de brettanomyces presentes en los vinos:<\/p>\n\n\n\n

  • Un efecto biol\u00f3gico: <\/strong>Interacci\u00f3n entre el quitosano y la membrana de brettanomyces que provoca una p\u00e9rdida de la viabilidad de estas \u00faltimas.<\/li>
  • Un efecto f\u00edsico:<\/strong> Interacci\u00f3n de carga entre el quitosano y la pared de brettanomyces que provoca la agregaci\u00f3n y la sedimentaci\u00f3n de brettanomyces.<\/li><\/ul>\n\n\n\n
    <\/div>\n\n\n\n

    Los resultados y perspectivas<\/strong><\/p>\n\n\n\n

    En referencia a la aplicaci\u00f3n en condiciones de bodega, se ha contrastado la eficacia del tratamiento gracias a las numerosas experiencias en diferentes matrices de vino, variedades y zonas vitivin\u00edcolas del mundo. Una parte importante de estos resultados se han obtenido en aplicaciones realizadas en bodegas de diferentes zonas de Espa\u00f1a.<\/p>\n\n\n\n

    Algunos de estos resultados se agrupan en la figura 6, en los que se sigue la evoluci\u00f3n de las poblaciones de brettanomyces despu\u00e9s de un tratamiento de 10 d\u00edas de quitosano No Brett Inside™<\/strong> a la dosis 4 g\/hL seguido por un trasiego. Estas medidas se realizaron 10 d\u00edas despu\u00e9s del trasiego y a los 3 meses del trasiego. En estas condiciones industriales en que las recomendaciones de aplicaci\u00f3n del quitosano de origen aspergillus niger han sido bien seguidas, la eficacia del tratamiento se demuestra sobre niveles de poblaci\u00f3n que pueden alcanzar niveles superiores a 104 UFC\/mL.<\/p>\n\n\n\n

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    Figura 6. Resultados de experiencias en bodegas tras un tratamiento de 10 d\u00edas de No Brett Inside™ a dosis 4 g\/hL.<\/strong><\/em> – Poblaci\u00f3n de Brettanomyces (UFC\/mL), RT-PCR<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n\n
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    En estas experiencias, se analizaron los niveles de fenoles vol\u00e1tiles en los tres momentos indicados anteriormente (antes de tratamiento, 10 d\u00edas y tres meses despu\u00e9s del mismo). No se observaron aumentos de los niveles de 4-etilfenol y 4-etilguayacol por parte de las c\u00e9lulas afectadas por el tratamiento, hecho que va en la l\u00ednea de los datos presentados sobre el efecto letal en un corto espacio de tiempo.<\/p>\n\n\n\n

    Por otra parte, se realizaron controles anal\u00edticos de otros par\u00e1metros enol\u00f3gicos, en los que se comprob\u00f3 la no incidencia de los tratamientos en la acidez del vino, pH, acidez vol\u00e1til, color o polifenoles totales. En cuanto al an\u00e1lisis sensorial no se perciben cambios desde el punto de vista arom\u00e1tico y la calidad gustativa del vino.<\/p>\n\n\n\n

    A notar que en el caso del an\u00e1lisis de las poblaciones residuales por RT-PCR, se pusieron en evidencia algunos resultados de falsos positivos a la cuantificaci\u00f3n de DNA presente en c\u00e9lulas muertas o en estado \u00absubletal\u00bb, si tras el trasiego no se respeta un cierto plazo (por lo menos 20 d\u00edas).<\/p>\n\n\n\n

    A partir de la experiencia y conocimientos sobre el modo de acci\u00f3n, se abrieron nuevos horizontes para explorar. Por ejemplo, cuando el vino se lleva a crianza durante un per\u00edodo prolongado, el en\u00f3logo puede estar interesado en un tiempo de contacto m\u00e1s prolongado con el quitosano No Brett Inside™<\/strong>, y retrasar el trasiego m\u00e1s de 10 d\u00edas despu\u00e9s de la incorporaci\u00f3n. Las ventajas se duplicar\u00e1n:<\/p>\n\n\n\n

    • En lugar de realizar un trasiego innecesario, el en\u00f3logo puede aprovechar el trasiego cl\u00e1sico para eliminar el producto. <\/li>
    • Sobre todo, retrasar el trasiego podr\u00eda proteger el vino de una posible recontaminaci\u00f3n con brettanomyces. <\/li><\/ul>\n\n\n\n

      En 2014, Nardi y Sieczkowski<\/strong> (6)<\/em> llevaron a cabo un experimento en Italia<\/strong> para probar estas hip\u00f3tesis y optimizar la utilizaci\u00f3n de quitosano No Brett Inside™<\/strong>. Un vino merlot y un vino sangiovese fueron inoculados con brettanomyces (103 c\u00e9lulas\/mL) y cada vino se separ\u00f3 en tres partes al\u00edcuotas:<\/p>\n\n\n\n

      • Un control no tratado, que se someti\u00f3 a b\u00e2tonnage una vez por semana.<\/li>
      • Dos al\u00edcuotas por vino tratado con No Brett Inside™<\/strong> (4 g\/hL), sin trasiego; en una de ellas se realiz\u00f3 un b\u00e2tonnage una vez por semana, el otro no se someti\u00f3 a b\u00e2tonnage.<\/li><\/ul>\n\n\n\n

        Cada vino en el ensayo fue analizado durante seis meses. El SO2 de todos los vinos se reajust\u00f3 despu\u00e9s de 200 d\u00edas.<\/p>\n\n\n\n

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        Figura 7: Contacto prolongado de No Brett Inside™ en crianza, con y sin b\u00e2tonage. Efecto sobre el desarrollo de Brettanomyces.<\/strong><\/em><\/figcaption><\/figure><\/div>\n\n\n\n
        <\/div>\n\n\n\n

        Los resultados (fig. 7) parecen mostrar el valor del contacto prolongado con No Brett Inside™ <\/strong>mientras tiene lugar la crianza del vino (6 y 9 meses,
        el caso del vino sangiovese, aunque no fomente el contacto repetido entre el producto y las c\u00e9lulas de levadura. Estas pruebas no permitieron llegar a una conclusi\u00f3n clara, pero podemos imaginar dos explicaciones:<\/p>\n\n\n\n

        • El b\u00e2tonnage<\/em> alent\u00f3 la regeneraci\u00f3n de Brettanomyces al poner las l\u00edas en suspensi\u00f3n e incorporar ox\u00edgeno, etc.<\/li>
        • El b\u00e2tonnage<\/em> result\u00f3 en un sesgo en la estimaci\u00f3n de la concentraci\u00f3n de Brettanomyces en los vinos, por resuspender y homogeneizar las c\u00e9lulas.<\/li><\/ul>\n\n\n\n

          Tambi\u00e9n se debe destacar el importante papel del SO2, ya que es una herramienta de control que sigue siendo necesaria y act\u00faa en sinergia con la acci\u00f3n del quitosano. Se est\u00e1n realizando diversas investigaciones adicionales en diferentes condiciones destinadas a completar y refinar estas conclusiones.<\/p>\n\n\n\n

          <\/div>\n\n\n\n

          Conclusiones<\/strong><\/p>\n\n\n\n

          A la luz de las experiencias llevadas a cabo por varios equipos de investigaci\u00f3n, as\u00ed como en laboratorios y bodegas, confirman que el quitosano puro de origen f\u00fangico (aspergillus niger) es una herramienta efectiva en la lucha contra la contaminaci\u00f3n por brettanomyces.<\/p>\n\n\n\n

          La incorporaci\u00f3n homog\u00e9nea de No Brett Inside™<\/strong> en el vino, una garant\u00eda de su efectividad, da como resultado la total destrucci\u00f3n de las poblaciones de brettanomyces o, en ciertos casos, una reducci\u00f3n significativa de las poblaciones contaminantes.<\/p>\n\n\n\n

          Es importante garantizar un protocolo de control adaptado a estos tratamientos, teniendo en cuenta la existencia de poblaciones subletales y la detecci\u00f3n de falsos positivos por ciertos m\u00e9todos de detecci\u00f3n. Diversas investigaciones han aclarado el modo de acci\u00f3n del quitosano frente a brettanomyces, al tiempo que destacan la velocidad de su acci\u00f3n, tanto para reducir la poblaci\u00f3n como para prevenir la aparici\u00f3n de fenoles vol\u00e1tiles.<\/p>\n\n\n\n

          No alerg\u00e9nico, de origen natural y sin impacto negativo en la calidad sensorial del vino, No Brett Inside™ de origen f\u00fangico<\/strong> es una herramienta innovadora para evitar la p\u00e9rdida de calidad generada por Brettanomyces bruxellensis.<\/p>\n\n\n\n

          <\/div>\n\n\n\n

          Bibliograf\u00eda<\/strong><\/p>\n\n\n\n

          (1) Barka EA. Chitosan improves development, and protects Vitis vinifera L. against Botrytis cinera. Plant Cell Reports 2004<\/strong>; 22 (8): 608-14.<\/em>
          (2) G\u00f3mez-Rivas L, Escudero-Abarca B, Aguilar-Uscanga MG, Hayward-Jones PM, Mendoza P, Ram\u00edrez M. Selective antimicrobial action of chitosan against spoilage yeasts in mixed culture fermentations.<\/strong> J Ind Microbiol Biotechnol 2004; 31: 16-22.<\/em>
          (3) Bornet A, Teisseidre PL. \u00c9limination des go\u00fbts terreux (la g\u00e9osmine) et des Brettanomyces par l\u2019utilisation d\u2019un biopolym\u00e8re fongique: le chitosane<\/strong>. OIV Proceedings, 2008.<\/em>
          (4) Blateyron-Pic L, Granes D, Sieczkowski N, Bornet A. Chitosane : un nouvel outil pour lutter contre Brettanomyces et pr\u00e9server les qualit\u00e9s aromatiques des vins.<\/strong> Le IXe symposium international d\u2019oenologie
          Bordeaux (France), 2011.<\/em>
          (5) Taillandier P, Joannis-Cassan C, Jentzer J-B, Gautier S, Sieczkowski N, Granes D, Brandam C. Effect of a fungal chitosan preparation on Brettanomyces bruxellensis, a wine contaminant.<\/strong> J Applied Microbiol 2014; 118:123-31.<\/em>
          (6) Nardi T, Vagnoli P, Minacci A, Gautier S, Sieczkowski N. Evaluating the impact of a fungal-origin chitosan preparation on Brettanomyces bruxellensis in the context of wine aging<\/strong>. Wine Studies 2014; 3: 4574<\/em><\/p>\n\n\n\n

          <\/div>\n\n\n\n

          Fuente: Lallemand Enolog\u00eda, Espa\u00f1a<\/strong><\/em><\/p>\n\n\n\n

          <\/div>\n\n\n\n
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